蒙古冰草(Agropyron mongolicum)亦称沙芦草, 为禾本科(Poaceae)小麦族(Triticeae)冰草属(Agropyron)多年生疏丛型牧草, 具有饲用价值高、抗寒耐旱以及耐盐、耐瘠薄、耐风沙等特性, 是改良天然草场的适宜草种与挖掘优良耐逆基因资源的重要材料。然而, 目前尚未建立蒙古冰草高效遗传转化体系, 制约了该物种的基因资源鉴定与遗传改良应用。以蒙农1号蒙古冰草种子为来源的高再生效率的胚性愈伤系#89为外植体, 建立了根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105介导的蒙古冰草稳定遗传转化体系, 转化效率达30%。此外, 针对多次继代后蒙古冰草愈伤系再生能力退化的难题, 通过在再生培养基中添加1 mg·L^-1 ABA或提高蔗糖浓度至45 g·L^-1, 成功将再生能力衰退的蒙古冰草愈伤系再生效率由5%分别提高至35%与42%。研究结果为后续蒙古冰草基因编辑体系建立、基因功能鉴定和新品种培育奠定了重要技术基础。

毛建草(Dracocephalum rupestre)是一种重要的药用植物。然而, 其叶片外植体再生系统尚未建立。以毛建草大田叶片和组培苗叶片为外植体, 探讨植物生长调节剂对愈伤组织诱导和分化、不定芽增殖及生根的影响, 建立了叶片离体再生体系。结果表明, 大田叶片愈伤组织诱导的最适培养基为MS+1.0 mg·L⁻¹ 6-BA+0.1 mg·L⁻¹ 2,4-D+1.0 mg·L⁻¹ IAA, 诱导率达84.51%, 不定芽分化最佳培养基为MS+3.0 mg·L⁻¹ 6-BA+0.5 mg·L⁻¹ TDZ+0.5 mg·L⁻¹ IAA, 分化率为66.37%; 组培苗叶片愈伤组织诱导的最适培养基为MS+2.0 mg·L⁻¹ 6-BA+0.1 mg·L⁻¹ 2,4-D+0.5 mg·L⁻¹ IAA, 诱导率达86.73%, 不定芽分化最佳培养基为MS+2.0 mg·L⁻¹ 6-BA+2.0 mg·L⁻¹ TDZ+0.05 mg·L⁻¹ IAA, 分化率为53.48%。不定芽增殖适宜培养基为MS+2.0 mg·L⁻¹ 6-BA+0.05 mg·L⁻¹ NAA, 增殖率为83.57%, 最适生根培养基为1/2MS+0.1 mg·L⁻¹ NAA+0.1 mg·L⁻¹ IBA, 生根率为86.97%; 在草炭:蛭石=1:1 (v/v)的混合基质中组培苗长势最好。该研究建立了毛建草叶片离体培养再生体系, 为毛建草种质资源保存和种苗快繁提供了技术支持。

以2个不同基因型的捕虫堇圆切捕虫堇(Pinguicula cyclosecta)和塞提捕虫堇(P. ‘Sethos’)叶片为外植体, 通过探究不定芽再生的影响因素, 成功建立了捕虫堇高效再生体系。结果表明, 2种捕虫堇对消毒方式和基本培养基种类要求相同, 但再生能力有显著差异。圆切捕虫堇叶片在MS+1.0 mg∙L^-1 6-BA+0.2 mg∙L^-1 NAA培养基上再生能力最强, 再生率为92.22%, 再生系数达4.84, 在MS+0.6 mg∙L^-1 6-BA+0.1 mg∙L^-1 NAA培养基上, 不定芽增殖系数达4.98。塞提捕虫堇叶片在MS+2.0 mg∙L^-1 6-BA+0.2 mg∙L^-1 NAA培养基中再生率最高, 为77.78%, 再生系数为6.12, 在增殖培养基MS+0.3 mg∙L^-1 6-BA+0.1 mg∙L^-1 NAA上, 增殖系数可达4.84。2种捕虫堇在1/2MS+0.1 mg∙L^-1 IBA培养基上进行生根培养, 根系生长状态最佳。该研究解决了捕虫堇繁殖系数低及工厂化育苗难等问题, 为其规模化生产和育种改良提供了技术支持。

为建立银扇草(Lunaria annua)体外再生体系, 以其真叶为外植体, 探讨消毒条件、植物生长调节剂组合及浓度对愈伤组织诱导、不定芽和不定根分化的影响; 进一步分析了生根方式对成苗和幼苗生长的影响。结果表明, 用75%乙醇消毒45秒配合0.1%升汞溶液消毒6分钟为银扇草叶片外植体最佳消毒处理; 真叶愈伤组织诱导及不定芽分化的最适培养基为MS+0.5 mg∙L^-1 6-BA+2.0 mg∙L^-1 2,4-D, 愈伤组织诱导率达93.37%, 不定芽分化率达84.08%; 最佳生根培养基为MS+ 0.1 mg∙L^-1 NAA, 从接种叶片外植体到获得再生植株约90天。该研究建立了银扇草稳定的再生体系, 为开发利用银扇草资源及挖掘功能基因奠定了基础。

以伊藤杂种‘和谐’(Itoh hybrids ‘He Xie’)的鳞芽为材料建立离体快繁技术体系, 可克服传统方法繁育较慢的缺点, 加速伊藤杂种优良品种的繁育推广。采用单因子试验设计, 分别探究不同灭菌时间、不同植物生长调节剂浓度、不同根诱导时间以及不同生根苗等级对‘和谐’组培苗启动、增殖、生根和驯化效果的影响。结果表明, 用2%次氯酸钠溶液的最佳灭菌时间为12分钟, 鳞芽污染率为9.09%; 最佳初始培养基配方为MS+1.5 mg∙L^-1 6-BA+0.2 mg∙L^-1 GA₃+0.5 mg∙L^-1 AgNO₃; 最佳增殖培养基配方为MS+450 mg∙L^-1 CaCl₂+0.5 mg∙L^-1 6-BA+0.2 mg∙L^-1 IBA+0.2 mg∙L^-1 GA₃+0.5 mg∙L^-1 AgNO₃, 增殖系数为3.3; 无根苗在根诱导培养基1/2MS+1.0 mg∙L^-1腐胺+2.0 mg∙L^-1 IBA上, 经4°C低温暗培养8天后常温光照培养30天, 再转入根形成培养基1/2MS+1.0 g∙L^-1 AC, 培养20天生根率达66.7%; 苗移栽的基质为珍珠岩:蛭石:草炭土=1:1:1 (v/v/v), 移栽60天后, 一级苗成活率最高为52.0%, 二级苗和三级苗则大部分死亡, 表明生根质量对移栽成活至关重要。

毛华菊(Chrysanthemum vestitum)是栽培菊花(C. × morifolium)的近缘六倍体野生种之一, 其自然群体中的舌状花与栽培菊花一样具有典型的平瓣型、管瓣型和混合瓣型变异, 是研究菊属植物瓣型变异的理想材料。其舌状花发育过程受生长素和花器官发育关键差异基因的影响, 但目前缺乏稳定高效的不同瓣型毛华菊株系的再生体系, 制约了毛华菊瓣型相关基因的研究。利用在河南省伏牛山收集的3种瓣型毛华菊株系, 以叶片和茎间薄层为外植体建立再生体系。结果表明, 以平瓣型叶片为外植体, 其愈伤组织诱导和不定芽分化最佳培养基为MS+1 mg∙L^-1 NAA+2 mg∙L^-1 6-BA, 接种20天愈伤组织诱导率为100%, 不定芽分化率达100%; 最佳生根培养基为1/2MS+0.2 mg∙L^-1 NAA, 生根率达100%。平瓣型毛华菊的叶片最佳再生体系也适用于管瓣型和混合瓣型株系, 不定芽分化率分别为83.46%和91.67%, 生根率均为100%。移栽后对开花植株进行观察, 发现利用叶片再生体系获得的3种不同瓣型再生植株花型稳定, 为后续利用不同瓣型株系解析舌状花形态变异机理提供了技术方法。

建立高效的大豆(Glycine max)转基因毛状根嵌合植株体系对于推动大豆功能基因组学研究具有重要意义。该研究利用3种大豆基因型材料比较了不同共培养条件下毛状根诱导率及成活率。结果显示, 用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染外植体并在黑暗条件下共培养1天是诱导毛状根形成的有效策略。研究发现清除下胚轴处不定根可显著增加毛状根的数目并促进根系生长, 进而提高转基因毛状根的阳性率。毛状根诱导14天接种根瘤菌, 可增强生长初期转基因毛状根与根瘤菌的接触, 从而提高大豆的结瘤效率。该研究成功建立了一种高效培育大豆转基因毛状根嵌合植株的方法, 可广泛应用于大豆基因功能研究。

以赤苍藤(Erythropalum scandens)带芽点的半木质化枝条为材料建立赤苍藤组培快繁体系, 研究外植体灭菌条件, 通过正交实验, 设计不同植物生长调节剂组合对赤苍藤愈伤组织诱导、愈伤组织分化、生根壮苗及移栽驯化的影响。结果表明, 赤苍藤外植体消毒最佳方法是以体积浓度为75%乙醇浸泡60秒后, 再以质量浓度为0.1% HgCl₂消毒10分钟, 成功率为48.89%; 叶片愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+0.5 mg·L^-1 6-BA+1.0 mg·L^-1 2,4-D+1.0 mg·L^-1 IBA, 培养30天, 诱导率达71.11%, 且绿色紧密; 茎段诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+1.0 mg·L^-1 6-BA+0.5 mg·L^-1 2,4-D+1.0 mg·L^-1 IBA, 培养30天, 诱导率为70.00%, 且绿色紧密; 诱导愈伤组织增殖以及分化的最佳培养基为MS+2.0 mg·L^-1 6-BA+0.5 mg·L^-1 TDZ+1.0 mg·L^-1 IBA, 芽分化率达98.89%, 增殖系数为3.33; 生根最佳培养基为MS+1.5 mg·L^-1 6-BA+0.5 mg·L^-1 IBA, 生根率为100%, 平均生根数为2.2条; 生根苗在小颗粒泥炭土中成活率达88.89%。该研究建立了赤苍藤组培快繁体系, 为赤苍藤优质种苗生产奠定了良好基础。

湖北地黄(Rehmannia henryi)是一种具有重要价值的药用植物, 其基因编辑研究还未见报道。为建立湖北地黄基因编辑体系, 克隆了类胡萝卜素合成途径中八氢番茄红素脱氢酶(PDS)的编码基因, 并构建RhPDS1基因的CRISPR/Cas9载体, 以根癌农杆菌介导法转化湖北地黄基因组。结果表明, RhPDS1转录本含1 764 bp的开放阅读框(ORF), 其推测的氨基酸序列具有八氢番茄红素脱氢酶的典型结构域。RhPDS1基因在蕾、花和嫩叶中的相对表达量较高。利用基因编辑获得3个具有白化表型的再生株系, 白化苗分化率为3.7%。测序结果表明, 3个突变体属于2个基因编辑事件, 靶点序列分别为1 bp或/和5 bp碱基缺失, 造成移码突变。白化苗突变体的叶绿素和类胡萝卜素含量极显著低于野生型, RhPDS1基因的表达量也显著下降。综上, 该研究克隆了RhPDS1基因, 并利用CRISPR/Cas9技术实现了对RhPDS1基因的靶向敲除, 为湖北地黄的功能基因组学研究和野生驯化奠定了技术基础。

红豆杉(Taxus spp.)为国家一级濒危植物, 含有药用价值高的广谱抗癌成分紫杉醇, 但资源匮乏。为解决紫杉醇药源短缺问题, 该研究建立了红豆杉紫杉烷类离体富集体系。结果表明, 最佳吸收面扩大培养基配方为MS+2 mg·L^-1 6-BA+0.4 mg·L^-1 NAA+0.7 g·L^-1脯氨酸, 扩大率达90%; 高频同步诱导率最高的培养基为DCR+1 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 NAA+5 mg·L^-1谷氨酰胺+1 g·L^-1活性炭, 高频同步率达82.2%; 生物量扩增I期效果最佳培养基为MS+0.7 mg·L^-1 6-BA+ 0.07 mg·L^-1 NAA+0.1 mg·L^-1苯丙氨酸+50 mg·L^-1间苯三酚, 芽苗生物量为每株542 mg; 生物量扩增II期效果较好的培养基为MS+0.5 mg·L^-1 6-BA+0.05 mg·L^-1 NAA+0.1 mg·L^-1苯丙氨酸+2 g·L^-1活性炭, 芽苗生物量为每株1 612 mg。富集培养后, 组培材料中紫杉烷类含量远高于天然材料, 紫杉醇含量为天然材料的6.1倍; 巴卡亭III含量为天然材料的8.2倍; 10-去乙酰基巴卡亭III含量为天然材料的68.1倍。该研究首次建立了红豆杉紫杉烷离体富集体系, 突破了紫杉醇药源短缺的瓶颈。

以手指柠檬(Citrus australasica)茎段为外植体, 通过离体器官发生途径诱导形成不定芽, 探讨不同植物生长调节剂组合、培养基类型以及暗培养时间对其愈伤组织诱导和植株再生的影响, 建立手指柠檬离体再生体系。结果表明, 1/2MS+4.0 mg∙L^-1 ZT+30.0 g∙L^-1蔗糖为手指柠檬茎段不定芽诱导的最佳配方, 14天暗培养后转移到光下培养效果最好, 愈伤组织及不定芽诱导率均为100%, 每外植体平均再生不定芽数达4.83。诱导不定根的适宜培养基配方为1/2MS+0.5 mg∙L^-1 NAA, 生根率达94.43%, 平均再生根数为3.9; 在草炭:珍珠岩:蛭石=2:1:1 (v/v/v)的混合基质中组培苗长势最好, 成活率在90%以上。该研究建立了手指柠檬茎段离体再生体系, 为手指柠檬的遗传改良和优良品种快繁奠定了基础。

质膜蛋白是细胞膜的重要组分之一, 在细胞的物质转运、离子交换、信号转导以及代谢过程中起着重要作用。质膜蛋白在膜上是运动的, 生长发育和环境因素均可改变其运动方式。因此, 研究影响质膜蛋白运动的因素及调控机制对于理解植物生长发育和应对环境改变至关重要。近年来, 显微技术发展迅速, 使得关于质膜蛋白动力学调控机制的研究逐步深入。该文详细介绍了质膜蛋白动力学及其影响因素, 概述了近几年在质膜蛋白动力学研究中常用的显微成像技术, 以期为深入研究质膜蛋白的生物学功能提供参考。

Tn5是一种细菌转座子。经改造的Tn5能够高效地切割DNA, 同时连接上特定的接头序列, 因而广泛应用于高通量二代测序文库构建中。CUT&Tag (Cleavage Under Target & Tagmentation)是一种改进的研究蛋白质与DNA互作的技术, 具有重复性好、信噪比高及操作简便等优点。该技术采用pA (Protein A)或pG (Protein G)与Tn5形成融合蛋白, 定位于特定抗体(用于识别目标蛋白), 利用Tn5的特性, 在目标位点附近打断DNA的同时引入测序接头, 随后提取DNA, 再进行PCR扩增即可获得测序文库。但不同类型的抗体与pA或pG的亲和力不同, 因此限制了部分抗体在CUT&Tag技术中的应用。为克服这一局限, 该文构建了pG与Tn5的融合蛋白表达载体, 通过原核表达及亲和纯化的方式获得pG-Tn5重组蛋白; 并以RNA聚合酶II (Pol II)特异性抗体Pol II Ser5P (小鼠IgG1型抗体和兔IgG型抗体)为例, 在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中评估pA-Tn5与pG-Tn5在不同类型抗体的CUT&Tag测序文库构建中的效果。结果表明, IgG1型抗体与pG-Tn5的亲和力更高, 构建的文库质量更好, 而IgG型抗体与2种酶的亲和力相当; 同时, 较低起始量的植物材料也能获得较好的效果, 证明了CUT&Tag的应用优势。该研究优化了CUT&Tag技术, 可为后续CUT&Tag实验中针对不同抗体时Tn5融合蛋白的选择提供参考。

染色体制备与识别技术是遗传学研究的重要手段, 而寡核苷酸荧光原位杂交(oligo-FISH)是近年来兴起的染色体识别技术。灵活高效的探针是荧光原位杂交过程中的关键因素。传统的单链寡核苷酸探针标记过程复杂, 且获得单个探针的成本较高。在单链寡核苷酸探针的基础上进行改良, 利用靶向全染色体(片段)的特异性引物进行扩增, 将获得产物纯化, 即可得到目的探针, 简化了探针标记过程, 降低了成本, 并提高了标记效率。该文详述了水稻(Oryza sativa)改良后的双链寡核苷酸探针文库的合成及标记方法、有丝分裂时期染色体制片和探针杂交过程。通过设计梯度实验发现水稻中寡核苷酸荧光原位杂交技术染色体和寡核苷酸探针的最佳变性时间与温度分别为85°C 3分钟30秒及90°C 6分钟。该研究在水稻中建立染色体双链寡核苷酸荧光原位杂交技术, 可为多种植物染色体制备与精准识别提供有力的工具。

野大麦(Hordeum brevisubulatum)为禾本科大麦属多年生草本植物, 具有较强的抗寒和耐盐碱能力, 是挖掘抗逆基因的优良种质资源。但目前尚未见野大麦遗传转化体系的报道。该研究以蒙农1号杂交野大麦成熟胚为外植体诱导愈伤组织, 建立了野大麦高效组培快繁体系, 分化率达70%, 快繁系数为35。在此基础上, 利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105菌株侵染筛选获得的高质量愈伤系YZ101, 通过优化侵染条件使侵染率接近30%。该体系的建立为野大麦功能基因组研究与分子设计育种奠定了基础。

菊科植物因其丰富的舌状花变异类型而具有很高的观赏价值。野菊(Chrysanthemum indicum)作为栽培菊花(C. × morifolium)的近缘野生种之一, 其自然群体中常具有典型的平瓣、匙瓣及管瓣的舌状花变异类型, 是研究菊科植物瓣型变异的优异材料, 而目前缺乏对其再生体系的研究。在福建平潭岛分布的野菊中发现大量舌状花形态变异植株, 该研究以其混合瓣型株系茎间薄层和叶盘为外植体建立再生体系。结果表明, 以茎间薄层为外植体, 诱导愈伤组织和不定芽分化的最优培养基为MS+1.0 mg∙L^-1 6-BA+0.5 mg∙L^-1 NAA, 接种14天愈伤组织诱导率可达100%。不定芽平均分化时间为25天, 接种40天不定芽分化率可达82%。最佳生根培养基为1/2MS+0.5 mg∙L^-1 NAA, 10天生根。移栽植株全部成活, 植株生长状态良好且均保留了混合瓣型的形态特征。该研究初步建立了平潭野菊混合瓣型株系茎间薄层的离体培养再生体系, 为进一步建立其遗传转化体系奠定了基础, 也为解析菊花瓣型变异机理提供了技术方法。

提取完整植物细胞核是流式细胞术检测前处理的关键步骤。分别以不同种属植物的新鲜叶片和大量硅胶快速干燥的植物叶片为研究材料, 比较新优化的细胞核提取液PVPK12-mGB₂与其它2种常见提取液(LB01和CyStain^® PI Absolute P)的提取效果。结果表明, 新优化的PVPK12-mGB₂细胞核提取液在测试多种富含干扰性次生代谢物的植物类群新鲜材料时效果最佳, 提取的细胞核质量基本能满足流式细胞术分析的要求。此外, 实验结果证实该细胞核提取液能够提升大量硅胶快速干燥保存植物材料的提取效果, 测试结果明显优于其它2种细胞核提取液。研究建立了用于DNA流式细胞术的植物样品前处理方法, 为野外采样分析提供了参考方法。

柳枝稷(Panicum virgatum)是重要的C₄多年生木质纤维素类生态能饲草。为了快速创制细胞壁转化效率高的能饲草新资源, 以异源四倍体柳枝稷品种Alamo为材料, 克隆了其木质素合成途径的阿魏酸-5-羟基化酶基因PvF5H, 并根据其序列设计编辑靶点, 用于构建CRISPR/Cas9-PvF5H编辑载体, 最后通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化方法, 获得了59株柳枝稷转基因阳性植株。测序分析表明, PvF5H在94.9%的转基因植株中被编辑, 纯合编辑效率为55.4%。该研究建立了高效的柳枝稷基因编辑系统, 实现了对细胞壁品质相关靶基因的有效编辑, 为今后能饲草新品种的培育奠定了基础。

茶树(Camellia sinensis)是重要的经济作物, 杂合度高且变异度大, 其高效离体再生体系鲜见报道。以舒茶早茎段为起始外植体, 进行不定芽高效发生影响因子研究。结果表明, MS+2 mg∙L^-1 6-BA为定芽诱导的最适配方, 定芽诱导率为84.44%, 吸收底盘膨大率为80%, 利于后续不定芽诱导; MS+2 mg∙L^-1 6-BA+0.2 mg∙L^-1 NAA+0.1 mg∙L^-1 KT+1 mg∙L^-1脯氨酸为不定芽增殖诱导的适宜配方, 不定芽诱导率为88.89%, 平均芽数为7.8。不定根诱导的适宜配方为1/2MS+3 mg∙L^-1 IBA, 生根率为85.56%。采用RAPD和ISSR技术对再生植株进行分子检测, 在连续2代离体再生植株中未发现明显变异。

为有效利用超高效液相-高分辨率飞行时间质谱(UPLC-TOF-MS)对酸性植物激素进行定性定量分析, 选取几种有机酸衍生化试剂: 2-溴苯乙酮(BP)、2-二甲氨基乙胺(DMED)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和溴代丙酮基三甲基溴化铵(BTA), 分别与脱落酸(ABA)、赤霉素(GA₃)、吲哚乙酸(IAA)、茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)进行衍生化反应。通过比较上述各植物激素的质谱响应值, 判断衍生化试剂的效果。将植物激素标准品进行浓度梯度稀释, 并与衍生化试剂反应, 测定它们的定量限。用衍生效果最佳的试剂与植物粗提液反应, 检验其应用效果。结果显示, 几种衍生化试剂均可大幅度提高酸性植物激素的质谱响应值, 其中DMED衍生后植物激素的质谱灵敏度提高幅度最大, 且反应稳定、重复性好。DMED衍生后, ABA、GA₃、IAA、JA和SA的定量限分别为0.05、0.2、0.1、0.1和0.5 ng∙mL^-1, 与未衍生化相比, 分别降低100、25、50、50和10倍, 即DMED衍生化使几种植物激素的质谱灵敏度提高10-100倍, 显著高于目前报道的灵敏度。将该方法应用于水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)和蚕豆(Vicia faba)等植物材料中, 有效测定了其酸性植物激素, 且灵敏度较衍生前显著提高。该研究建立了一种简单、快速且重现性好的基于衍生化的UPLC-TOF-MS测定方法, 大幅提高了多种酸性植物激素测定的灵敏度。

植物病毒病是制约农作物安全生产的重要因素, 病毒检测能够发现病毒并确定病毒的种类, 是病害监测预警和防控的关键。该研究以马铃薯Y病毒(PVY)为检测对象, 建立了基于RPA-CRISPR/Cas12a的检测体系。结果表明, (1) CRISPR/ Cas12a检测体系内Cas12a及各组分为检测顺利进行所必要; (2) crRNA的靶点位置对Cas12a蛋白活性有较大影响, 当crRNA的靶点包含部分PAM位点序列时, 反应效率最高; (3) RPA-CRISPR/Cas12a检测模板的最低限度为3×10² copies∙μL^-1, 灵敏度高于PCR及qPCR检测法; (4) RPA-CRISPR/Cas12a检测体系与核酸粗提及逆转录反应联合, 可在非实验室环境下进行PVY检测, 整个过程耗时约60分钟。该研究建立了基于RPA-CRISPR/Cas12a的PVY检测技术体系, 为在非实验室条件下实时快速检测植物病毒提供了一种有效方法。

遗传转化是植物基因工程的重要手段。快速、高效地将目的基因导入植物细胞, 并缩短获得转基因后代的时间是遗传转化的关键。花生(Arachis hypogaea)是我国重要的油料及经济作物。目前花生的遗传转化体系尚未完善, 制约着花生的基因功能解析和分子育种进程。该文建立了一套快速、稳定的花生遗传转化体系。通过将农杆菌注射于花生第2茎节的切面获得转化植株, 再将阳性植株进行移栽和回土, 采摘注射点以上的荚果进行后续鉴定与分析。结果表明, 利用该方法可获得40%以上的T₀代嵌合体植株, 约5个月可收获T₀代花生种子, 其中约有9%的T₁代花生植株为非嵌合体的杂合体。针对部分转基因植株结实少的问题, 进一步提出了将快速转化体系与传统组培方法相结合的优化方案。构建的快速转化方法对大蒜(Allium sativum)、马铃薯(Solanum tuberosum)和香雪兰(Freesia refracta)的遗传转化具有潜在应用价值, 对其它植物的遗传转化也有重要参考价值。

近年来, 茶树基因组测序的完成为茶树在分子和基因水平的研究奠定了基础。但由于转基因技术尚不成熟且茶树生长周期较长, 茶树的基因功能研究依然不能有效开展。采用铁观音(Camellia sinensis var. sinensis cv. ‘Tieguanyin’)实生幼苗叶片, 通过筛选多种纤维素酶、果胶酶、离析酶和甘露醇的浓度组合, 并结合原生质体的数量、活性和杂质含量综合确定了最佳配方, 成功建立了铁观音茶苗叶片原生质体提取和PEG介导的高效瞬时转化体系, 转化率达56.25%。利用该系统探索了茶氨酸代谢通路中2个重要合成酶(茶氨酸合成酶(TSI)和谷氨酰胺合成酶(GSII-1.1))的亚细胞定位。研究发现, 这2种酶均定位于铁观音原生质体细胞质中。茶苗叶片原生质体提取和瞬时转化体系的建立为茶树基因组功能研究奠定了技术基础。

以粉美人萱草(Hemerocallis fulva cv. ‘Fenmeiren’)的花茎为外植体进行离体培养, 该研究成功建立了粉美人萱草组培快繁技术。结果表明, 6月获得的外植体用浓度为15% (v/v)的次氯酸钠溶液消毒8分钟, 外植体存活率达95%; 最佳增殖培养基为MS+1.0 mg·L^-1 6-BA+0.004 mg·L^-1 TDZ+0.1 mg·L^-1 NAA, 培养30天后, 月增殖系数达2.9; 壮苗培养基为MS+0.1 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 IBA, 在该培养基中, 组培苗不再分化, 长势健壮; 最佳生根培养基为1/2MS+0.4 mg·L^-1 IBA+20 g·L^-1蔗糖, 生根率达95%; 移栽基质采用珍珠岩:草炭=1:2 (v/v), 通过精细化管理, 成活率可达85%, 出圃合格率为75%。目前已实现规模化繁殖, 并生产组培苗2.0×10⁵株, 大田种植表现良好。

为建立野生大花银莲花(Anemone silvestris)组培再生体系, 分别以无菌苗上、下胚轴、叶片和叶柄为外植体, 探讨不同浓度植物生长调节剂对不同外植体的愈伤组织诱导、不定芽分化、增殖与生根的影响。结果表明, 4种外植体均可诱导出不定芽, 其中上胚轴诱导效果最佳, 其在1/2MS+2.0 mg∙L^-1 6-BA+0.1 mg∙L^-1 NAA培养基中诱导率最高, 为86.67%; 最适增殖培养基为1/2MS+1.0 mg∙L^-1 6-BA+0.05 mg∙L^-1 NAA, 增殖系数为3.67; 最佳生根培养基为1/2MS+0.3 mg∙L^-1 IBA, 生根率为100%; 在草炭:蛭石=2:1 (v/v)的栽培基质中, 组培苗的移栽成活率最高, 为98.33%。该研究有效解决了野生大花银莲花在园林及药用生产上的种质资源紧缺难题, 为工厂化育苗提供了技术支撑。

为了提高樟叶越桔(Vaccinium dunalianum)悬浮培养细胞的生物量, 以樟叶越桔叶片愈伤组织为试材, 通过单因素试验探究不同蔗糖浓度、培养基pH值、培养基体积、初始接种量和摇床转速对悬浮培养细胞生长的影响, 并根据响应面法Box-Behnken试验设计原理进行组合试验以优化培养条件。结果显示, 以改良WPM培养基为基础培养基, 樟叶越桔细胞悬浮培养的最优条件为40 g·L^-1蔗糖、培养基pH5.2、培养基体积45 mL、初始接种量2.64 g和摇床转速为149 r·min^-1, 其细胞生物量干重为0.184 4 g, 与理论预测值0.184 5 g较为接近, 且细胞的生长曲线呈S型。研究结果为樟叶越桔悬浮培养细胞次生代谢产物的生产调控奠定了技术基础。

尝试利用天然低共熔溶剂(NADES)提取甜叶菊(Stevia rebaudiana)中的甜菊糖, 探索一种高效、绿色和环保的甜菊糖提取新方法。以甜叶菊干叶为原料, 对照传统提取溶剂水, 以甜菊糖中甜菊苷和莱鲍迪苷A的提取浓度作为指标, 筛选出最优的NADES提取配方, 然后通过Box-Behnken响应面法对NADES提取甜叶菊中甜菊糖的工艺条件进行筛选优化。结果表明, 提取效率最高的NADES配方为1,2-丙二醇:甘油:水=8:1:1 (v/v/v), 提取的甜菊苷浓度为2.59 mg∙mL^-1, 比水提取高16.40%, 提取的莱鲍迪苷A浓度为1.06 mg∙mL^-1, 比水提取高12.62%; 通过响应面法得到最优提取条件: 提取时间90分钟, 提取温度60°C, 超声功率为80 J∙s^-1, 预测甜菊苷提取浓度为3.49 mg∙mL^-1, 莱鲍迪苷A提取浓度为1.43 mg∙mL^-1, 与实验验证值(甜菊苷浓度为3.48 mg∙mL^-1, 莱鲍迪苷A浓度为1.42 mg∙mL^-1)接近。在最优条件下, 甜菊苷提取浓度比初始条件提高了34.36%, 莱鲍迪甘A提取浓度比初始条件提高了33.96%。NADES绿色环保, 且提取效率高于传统溶剂, 可用于甜叶菊中甜菊糖的绿色提取; 同时, 该提取方法可为后续推广至其它大宗经济植物类天然产物的绿色工业生产提供参考。

以毛报春(Primula × pubescens)无菌腋芽为外植体, 分析不同浓度激素配比对愈伤组织诱导和分化以及不定芽增殖和生根的影响, 筛选出不同阶段的最适培养基, 优化毛报春的组织培养再生体系。结果表明, 毛报春腋芽愈伤组织诱导及分化的最适培养基为MS+0.2 mg∙L^-1 NAA+1.0 mg∙L^-1 6-BA, 诱导率达84%, 出芽率达67%; 不定芽增殖最适培养基为MS+0.5 mg∙L^-1 NAA+0.2 mg∙L^-1 6-BA, 增殖率可达67%, 苗绿且健壮; MS+0.2 mg∙L^-1 NAA培养基最有利于组培苗的生根及伸长, 平均单株生根数为9条, 生根率高达70%。该研究建立了毛报春的组织培养再生体系, 可为报春属其它植物的遗传研究及种质创新提供参考。

光谱技术已广泛应用于光合研究领域, 如光吸收信号P515和P700氧化还原动力学以及叶绿素荧光等, 可快速、准确地检测植物的光合活性。P515信号广泛存在于高等植物和藻类中, 是类囊体膜上的色素分子吸收光能后, 其吸收光谱发生位移造成。利用光诱导的P515快速和慢速动力学, 可检测PSI和PSII反应中心的比值、ATP合酶的质子传导性、围绕PSI的环式电子传递速率、质子动力势及其组分, 还可通过同步检测叶绿素荧光和P515信号研究光保护机制。该文总结了P515的主要测量原理、方法及其应用, 旨在为深入研究光合作用机理提供技术支持。

以莲(Nelumbo nucifera)授粉后18天的莲子胚芽为外植体, 通过初代培养、继代培养和炼苗移栽, 建立了莲离体快速繁殖体系。结果表明, 将胚芽外植体诱导出无菌苗的最适初代培养基为MS固体培养基添加0.5 mg∙L^-1 6-BA、0.5 mg∙L^-1 NAA、30 g∙L^-1蔗糖、0.5 g∙L^-1活性炭和0.8 g∙L^-1琼脂, 培养60天诱导率高于85%, 其中秋红阳走茎节数最多(3.9)。最佳继代培养基为将初代培养基中的蔗糖浓度提高到80 g∙L^-1, 走茎采用两节一切的分苗切法, 无菌苗可50天继代1次, 最多可继代6次, 不同品种的增殖系数介于4.0-6.7之间, 以秋红阳最高(6.7)。于5-7月将生根的走茎无菌苗移栽入泥炭:塘泥=1:2 (v/v)的混合基质中进行培养, 成活率均大于83.9%。采用上述快繁技术, 理论上1个莲子胚芽经过近1年可繁殖出种苗1 465株。该研究建立了莲的离体快繁技术体系, 可为莲种苗的规模化生产提供技术支持。

以芍药(Paeonia lactiflora)品种粉玉奴花药为外植体, 研究不同浓度2,4-D对愈伤组织诱导、体胚发生及植株再生的影响, 采用组织细胞学方法观察愈伤组织以及体细胞胚发育过程, 采用根尖染色体法鉴定再生植株倍性。结果表明, 芍药花药愈伤组织诱导的最适培养基为MS+1 mg·L^-12,4-D+1 mg·L^-1 NAA+0.1 mg·L^-1 KT+30 g·L^-1蔗糖+6.5 g·L^-1琼脂, 愈伤组织诱导率为14.7%。转入体细胞胚诱导培养基上, 历经球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚阶段, 体胚诱导率为52.1%; 在成苗培养基中能够长出真叶并得到完整植株, 成苗率为47.1%。经根尖染色体法鉴定出单倍体和二倍体植株。该研究初步建立了通过体细胞胚间接发生途径实现植株再生的培养体系, 可为芍药属其它品种的花药培养提供借鉴, 获得的再生植株是芍药遗传学研究和育种工作的重要材料。

为建立郁金樱(Cerasus serrulata var. lannesiana cv. ‘Grandiflora’)再生体系, 以多年生母株小叶、一年生嫁接苗小叶、腋芽诱导小叶和增殖一代小叶为外植体, 探讨不同外植体和植物激素组合对郁金樱愈伤组织诱导、不定芽分化、增殖和生根的影响。结果表明, 4种外植体均可诱导出愈伤组织, 除多年生母株小叶外皆分化出不定芽, 外植体幼化程度越高, 后期培养潜力越大。以增殖一代小叶为外植体效果最佳, 其最适愈伤组织诱导培养基为MS+0.5 mg·L^-16-BA+1.0 mg·L^-12,4-D, 诱导率达96.22%; 最佳分化培养基为MS+1.0 mg·L^-16-BA+0.1 mg·L^-12,4-D+0.1 mg·L^-1TDZ, 分化率达78.14%; 最佳增殖培养基为MS+1.0 mg·L^-16-BA, 增殖系数可达7.85; 最佳生根培养基为不含任何激素的1/2MS培养基, 生根率达100%。不同外植体获得的再生植株移栽成活后生长差异显著, 以增殖一代小叶诱导的再生植株长势最佳。

建立简便、快速和无损种子连续取样技术流程及基因型鉴定技术体系, 可节约种植成本及缩短鉴定周期, 提高基因功能研究和育种效率。该研究利用微型电钻和空气泵等简单装置设计了一种连续且无损钻取大豆(Glycine max)种子组织的方法, 并优化了利用384深孔微孔板高通量提取DNA及基因型鉴定技术体系。该方法也可用于水稻(Oryza sativa)和玉米(Zea mays)等多种主要作物的种子取样及基因型鉴定。

川草2号老芒麦(Elymus sibiricus)是青藏高原地区治理荒漠化和建设高产人工草地的主要栽培草种。用川草2号老芒麦5种外植体诱导愈伤组织, 经分化测试, 仅幼穗愈伤组织能分化再生。以当代培养25天和35天的结构致密坚硬的幼穗愈伤组织为受体, 分别进行农杆菌侵染和基因枪转化, 结果只有基因枪能转化成功。在基因枪转化过程中, 采用高渗培养和滤纸干燥2种方式预处理愈伤组织, 结果表明滤纸干燥处理比高渗处理转化效率高。当代诱导25天的幼穗愈伤组织, 滤纸干燥处理2小时转化效率最高, 达40%。该研究成功获得了基因枪转化的以川草2号老芒麦幼穗愈伤为受体的阳性愈伤组织。