建立高效的大豆(Glycine max)转基因毛状根嵌合植株体系对于推动大豆功能基因组学研究具有重要意义。该研究利用3种大豆基因型材料比较了不同共培养条件下毛状根诱导率及成活率。结果显示, 用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染外植体并在黑暗条件下共培养1天是诱导毛状根形成的有效策略。研究发现清除下胚轴处不定根可显著增加毛状根的数目并促进根系生长, 进而提高转基因毛状根的阳性率。毛状根诱导14天接种根瘤菌, 可增强生长初期转基因毛状根与根瘤菌的接触, 从而提高大豆的结瘤效率。该研究成功建立了一种高效培育大豆转基因毛状根嵌合植株的方法, 可广泛应用于大豆基因功能研究。

以赤苍藤(Erythropalum scandens)带芽点的半木质化枝条为材料建立赤苍藤组培快繁体系, 研究外植体灭菌条件, 通过正交实验, 设计不同植物生长调节剂组合对赤苍藤愈伤组织诱导、愈伤组织分化、生根壮苗及移栽驯化的影响。结果表明, 赤苍藤外植体消毒最佳方法是以体积浓度为75%乙醇浸泡60秒后, 再以质量浓度为0.1% HgCl₂消毒10分钟, 成功率为48.89%; 叶片愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+0.5 mg·L^-1 6-BA+1.0 mg·L^-1 2,4-D+1.0 mg·L^-1 IBA, 培养30天, 诱导率达71.11%, 且绿色紧密; 茎段诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+1.0 mg·L^-1 6-BA+0.5 mg·L^-1 2,4-D+1.0 mg·L^-1 IBA, 培养30天, 诱导率为70.00%, 且绿色紧密; 诱导愈伤组织增殖以及分化的最佳培养基为MS+2.0 mg·L^-1 6-BA+0.5 mg·L^-1 TDZ+1.0 mg·L^-1 IBA, 芽分化率达98.89%, 增殖系数为3.33; 生根最佳培养基为MS+1.5 mg·L^-1 6-BA+0.5 mg·L^-1 IBA, 生根率为100%, 平均生根数为2.2条; 生根苗在小颗粒泥炭土中成活率达88.89%。该研究建立了赤苍藤组培快繁体系, 为赤苍藤优质种苗生产奠定了良好基础。

湖北地黄(Rehmannia henryi)是一种具有重要价值的药用植物, 其基因编辑研究还未见报道。为建立湖北地黄基因编辑体系, 克隆了类胡萝卜素合成途径中八氢番茄红素脱氢酶(PDS)的编码基因, 并构建RhPDS1基因的CRISPR/Cas9载体, 以根癌农杆菌介导法转化湖北地黄基因组。结果表明, RhPDS1转录本含1 764 bp的开放阅读框(ORF), 其推测的氨基酸序列具有八氢番茄红素脱氢酶的典型结构域。RhPDS1基因在蕾、花和嫩叶中的相对表达量较高。利用基因编辑获得3个具有白化表型的再生株系, 白化苗分化率为3.7%。测序结果表明, 3个突变体属于2个基因编辑事件, 靶点序列分别为1 bp或/和5 bp碱基缺失, 造成移码突变。白化苗突变体的叶绿素和类胡萝卜素含量极显著低于野生型, RhPDS1基因的表达量也显著下降。综上, 该研究克隆了RhPDS1基因, 并利用CRISPR/Cas9技术实现了对RhPDS1基因的靶向敲除, 为湖北地黄的功能基因组学研究和野生驯化奠定了技术基础。

红豆杉(Taxus spp.)为国家一级濒危植物, 含有药用价值高的广谱抗癌成分紫杉醇, 但资源匮乏。为解决紫杉醇药源短缺问题, 该研究建立了红豆杉紫杉烷类离体富集体系。结果表明, 最佳吸收面扩大培养基配方为MS+2 mg·L^-1 6-BA+0.4 mg·L^-1 NAA+0.7 g·L^-1脯氨酸, 扩大率达90%; 高频同步诱导率最高的培养基为DCR+1 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 NAA+5 mg·L^-1谷氨酰胺+1 g·L^-1活性炭, 高频同步率达82.2%; 生物量扩增I期效果最佳培养基为MS+0.7 mg·L^-1 6-BA+ 0.07 mg·L^-1 NAA+0.1 mg·L^-1苯丙氨酸+50 mg·L^-1间苯三酚, 芽苗生物量为每株542 mg; 生物量扩增II期效果较好的培养基为MS+0.5 mg·L^-1 6-BA+0.05 mg·L^-1 NAA+0.1 mg·L^-1苯丙氨酸+2 g·L^-1活性炭, 芽苗生物量为每株1 612 mg。富集培养后, 组培材料中紫杉烷类含量远高于天然材料, 紫杉醇含量为天然材料的6.1倍; 巴卡亭III含量为天然材料的8.2倍; 10-去乙酰基巴卡亭III含量为天然材料的68.1倍。该研究首次建立了红豆杉紫杉烷离体富集体系, 突破了紫杉醇药源短缺的瓶颈。

以手指柠檬(Citrus australasica)茎段为外植体, 通过离体器官发生途径诱导形成不定芽, 探讨不同植物生长调节剂组合、培养基类型以及暗培养时间对其愈伤组织诱导和植株再生的影响, 建立手指柠檬离体再生体系。结果表明, 1/2MS+4.0 mg∙L^-1 ZT+30.0 g∙L^-1蔗糖为手指柠檬茎段不定芽诱导的最佳配方, 14天暗培养后转移到光下培养效果最好, 愈伤组织及不定芽诱导率均为100%, 每外植体平均再生不定芽数达4.83。诱导不定根的适宜培养基配方为1/2MS+0.5 mg∙L^-1 NAA, 生根率达94.43%, 平均再生根数为3.9; 在草炭:珍珠岩:蛭石=2:1:1 (v/v/v)的混合基质中组培苗长势最好, 成活率在90%以上。该研究建立了手指柠檬茎段离体再生体系, 为手指柠檬的遗传改良和优良品种快繁奠定了基础。

质膜蛋白是细胞膜的重要组分之一, 在细胞的物质转运、离子交换、信号转导以及代谢过程中起着重要作用。质膜蛋白在膜上是运动的, 生长发育和环境因素均可改变其运动方式。因此, 研究影响质膜蛋白运动的因素及调控机制对于理解植物生长发育和应对环境改变至关重要。近年来, 显微技术发展迅速, 使得关于质膜蛋白动力学调控机制的研究逐步深入。该文详细介绍了质膜蛋白动力学及其影响因素, 概述了近几年在质膜蛋白动力学研究中常用的显微成像技术, 以期为深入研究质膜蛋白的生物学功能提供参考。

Tn5是一种细菌转座子。经改造的Tn5能够高效地切割DNA, 同时连接上特定的接头序列, 因而广泛应用于高通量二代测序文库构建中。CUT&Tag (Cleavage Under Target & Tagmentation)是一种改进的研究蛋白质与DNA互作的技术, 具有重复性好、信噪比高及操作简便等优点。该技术采用pA (Protein A)或pG (Protein G)与Tn5形成融合蛋白, 定位于特定抗体(用于识别目标蛋白), 利用Tn5的特性, 在目标位点附近打断DNA的同时引入测序接头, 随后提取DNA, 再进行PCR扩增即可获得测序文库。但不同类型的抗体与pA或pG的亲和力不同, 因此限制了部分抗体在CUT&Tag技术中的应用。为克服这一局限, 该文构建了pG与Tn5的融合蛋白表达载体, 通过原核表达及亲和纯化的方式获得pG-Tn5重组蛋白; 并以RNA聚合酶II (Pol II)特异性抗体Pol II Ser5P (小鼠IgG1型抗体和兔IgG型抗体)为例, 在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中评估pA-Tn5与pG-Tn5在不同类型抗体的CUT&Tag测序文库构建中的效果。结果表明, IgG1型抗体与pG-Tn5的亲和力更高, 构建的文库质量更好, 而IgG型抗体与2种酶的亲和力相当; 同时, 较低起始量的植物材料也能获得较好的效果, 证明了CUT&Tag的应用优势。该研究优化了CUT&Tag技术, 可为后续CUT&Tag实验中针对不同抗体时Tn5融合蛋白的选择提供参考。

染色体制备与识别技术是遗传学研究的重要手段, 而寡核苷酸荧光原位杂交(oligo-FISH)是近年来兴起的染色体识别技术。灵活高效的探针是荧光原位杂交过程中的关键因素。传统的单链寡核苷酸探针标记过程复杂, 且获得单个探针的成本较高。在单链寡核苷酸探针的基础上进行改良, 利用靶向全染色体(片段)的特异性引物进行扩增, 将获得产物纯化, 即可得到目的探针, 简化了探针标记过程, 降低了成本, 并提高了标记效率。该文详述了水稻(Oryza sativa)改良后的双链寡核苷酸探针文库的合成及标记方法、有丝分裂时期染色体制片和探针杂交过程。通过设计梯度实验发现水稻中寡核苷酸荧光原位杂交技术染色体和寡核苷酸探针的最佳变性时间与温度分别为85°C 3分钟30秒及90°C 6分钟。该研究在水稻中建立染色体双链寡核苷酸荧光原位杂交技术, 可为多种植物染色体制备与精准识别提供有力的工具。

野大麦(Hordeum brevisubulatum)为禾本科大麦属多年生草本植物, 具有较强的抗寒和耐盐碱能力, 是挖掘抗逆基因的优良种质资源。但目前尚未见野大麦遗传转化体系的报道。该研究以蒙农1号杂交野大麦成熟胚为外植体诱导愈伤组织, 建立了野大麦高效组培快繁体系, 分化率达70%, 快繁系数为35。在此基础上, 利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105菌株侵染筛选获得的高质量愈伤系YZ101, 通过优化侵染条件使侵染率接近30%。该体系的建立为野大麦功能基因组研究与分子设计育种奠定了基础。

菊科植物因其丰富的舌状花变异类型而具有很高的观赏价值。野菊(Chrysanthemum indicum)作为栽培菊花(C. × morifolium)的近缘野生种之一, 其自然群体中常具有典型的平瓣、匙瓣及管瓣的舌状花变异类型, 是研究菊科植物瓣型变异的优异材料, 而目前缺乏对其再生体系的研究。在福建平潭岛分布的野菊中发现大量舌状花形态变异植株, 该研究以其混合瓣型株系茎间薄层和叶盘为外植体建立再生体系。结果表明, 以茎间薄层为外植体, 诱导愈伤组织和不定芽分化的最优培养基为MS+1.0 mg∙L^-1 6-BA+0.5 mg∙L^-1 NAA, 接种14天愈伤组织诱导率可达100%。不定芽平均分化时间为25天, 接种40天不定芽分化率可达82%。最佳生根培养基为1/2MS+0.5 mg∙L^-1 NAA, 10天生根。移栽植株全部成活, 植株生长状态良好且均保留了混合瓣型的形态特征。该研究初步建立了平潭野菊混合瓣型株系茎间薄层的离体培养再生体系, 为进一步建立其遗传转化体系奠定了基础, 也为解析菊花瓣型变异机理提供了技术方法。

提取完整植物细胞核是流式细胞术检测前处理的关键步骤。分别以不同种属植物的新鲜叶片和大量硅胶快速干燥的植物叶片为研究材料, 比较新优化的细胞核提取液PVPK12-mGB₂与其它2种常见提取液(LB01和CyStain^® PI Absolute P)的提取效果。结果表明, 新优化的PVPK12-mGB₂细胞核提取液在测试多种富含干扰性次生代谢物的植物类群新鲜材料时效果最佳, 提取的细胞核质量基本能满足流式细胞术分析的要求。此外, 实验结果证实该细胞核提取液能够提升大量硅胶快速干燥保存植物材料的提取效果, 测试结果明显优于其它2种细胞核提取液。研究建立了用于DNA流式细胞术的植物样品前处理方法, 为野外采样分析提供了参考方法。

柳枝稷(Panicum virgatum)是重要的C₄多年生木质纤维素类生态能饲草。为了快速创制细胞壁转化效率高的能饲草新资源, 以异源四倍体柳枝稷品种Alamo为材料, 克隆了其木质素合成途径的阿魏酸-5-羟基化酶基因PvF5H, 并根据其序列设计编辑靶点, 用于构建CRISPR/Cas9-PvF5H编辑载体, 最后通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化方法, 获得了59株柳枝稷转基因阳性植株。测序分析表明, PvF5H在94.9%的转基因植株中被编辑, 纯合编辑效率为55.4%。该研究建立了高效的柳枝稷基因编辑系统, 实现了对细胞壁品质相关靶基因的有效编辑, 为今后能饲草新品种的培育奠定了基础。

茶树(Camellia sinensis)是重要的经济作物, 杂合度高且变异度大, 其高效离体再生体系鲜见报道。以舒茶早茎段为起始外植体, 进行不定芽高效发生影响因子研究。结果表明, MS+2 mg∙L^-1 6-BA为定芽诱导的最适配方, 定芽诱导率为84.44%, 吸收底盘膨大率为80%, 利于后续不定芽诱导; MS+2 mg∙L^-1 6-BA+0.2 mg∙L^-1 NAA+0.1 mg∙L^-1 KT+1 mg∙L^-1脯氨酸为不定芽增殖诱导的适宜配方, 不定芽诱导率为88.89%, 平均芽数为7.8。不定根诱导的适宜配方为1/2MS+3 mg∙L^-1 IBA, 生根率为85.56%。采用RAPD和ISSR技术对再生植株进行分子检测, 在连续2代离体再生植株中未发现明显变异。

为有效利用超高效液相-高分辨率飞行时间质谱(UPLC-TOF-MS)对酸性植物激素进行定性定量分析, 选取几种有机酸衍生化试剂: 2-溴苯乙酮(BP)、2-二甲氨基乙胺(DMED)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和溴代丙酮基三甲基溴化铵(BTA), 分别与脱落酸(ABA)、赤霉素(GA₃)、吲哚乙酸(IAA)、茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)进行衍生化反应。通过比较上述各植物激素的质谱响应值, 判断衍生化试剂的效果。将植物激素标准品进行浓度梯度稀释, 并与衍生化试剂反应, 测定它们的定量限。用衍生效果最佳的试剂与植物粗提液反应, 检验其应用效果。结果显示, 几种衍生化试剂均可大幅度提高酸性植物激素的质谱响应值, 其中DMED衍生后植物激素的质谱灵敏度提高幅度最大, 且反应稳定、重复性好。DMED衍生后, ABA、GA₃、IAA、JA和SA的定量限分别为0.05、0.2、0.1、0.1和0.5 ng∙mL^-1, 与未衍生化相比, 分别降低100、25、50、50和10倍, 即DMED衍生化使几种植物激素的质谱灵敏度提高10-100倍, 显著高于目前报道的灵敏度。将该方法应用于水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)和蚕豆(Vicia faba)等植物材料中, 有效测定了其酸性植物激素, 且灵敏度较衍生前显著提高。该研究建立了一种简单、快速且重现性好的基于衍生化的UPLC-TOF-MS测定方法, 大幅提高了多种酸性植物激素测定的灵敏度。