野大麦高效组培快繁及农杆菌介导的愈伤侵染体系建立

doi:10.11983/CBB22221

植物学报 ›› 2023, Vol. 58 ›› Issue (3): 440-448.DOI: 10.11983/CBB22221

野大麦高效组培快繁及农杆菌介导的愈伤侵染体系建立

刘叶飞¹^,², 赵海霞², 姜希萍², 邱锐¹^,², 周昕越¹, 赵彦¹(), 付春祥²()

¹内蒙古农业大学草原与资源环境学院/农业农村部饲草栽培、加工与高效利用重点实验室/草地资源教育部重点实验室, 呼和浩特 010018
²中国科学院青岛生物能源与过程研究所, 中国科学院生物燃料重点实验室, 山东省能源研究院, 山东省能源生物遗传资源重点实验室青岛新能源山东省实验室, 青岛 266101

收稿日期:2022-09-13 接受日期:2022-11-15 出版日期:2023-05-01 发布日期:2023-05-17
通讯作者: *E-mail: zhaoyannmg@163.com; fucx@qibebt.ac.cn
基金资助:
内蒙古自治区关键技术攻关计划(2020GG0176);“科技兴蒙”重点专项(2020-科技兴蒙-草种业技术创新中心-2);国家自然科学基金(32160326);中国科学院战略性先导科技专项(A类)(XDA26030301)

Establishment of Highly Efficient Tissue Culture and Agrobacterium-mediated Callus Infection Systems for Hordeum brevisubulatum

Yefei Liu¹^,², Haixia Zhao², Xiping Jiang², Rui Qiu¹^,², Xinyue Zhou¹, Yan Zhao¹(), Chunxiang Fu²()

¹Key Laboratory of Grassland Resources of Ministry of Education/Key Laboratory of Forage Cultivation, Processing and Eficient Utilization of Ministry of Agriculture and Rural Areas/College of Grassland, Resources And Environment of Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
²Qingdao New Energy Shandong Laboratory, Shandong Key Laboratory of Energy Biogenetic Resources, Shandong Energy Research Institute, Key Laboratory of Biofuels, Chinese Academy of Sciences, Qingdao Institute of Bioenergy and Process, Chinese Academy of Sciences Qingdao 266101, China

Received:2022-09-13 Accepted:2022-11-15 Online:2023-05-01 Published:2023-05-17
Contact: *E-mail: zhaoyannmg@163.com; fucx@qibebt.ac.cn

摘要/Abstract

摘要： 野大麦(Hordeum brevisubulatum)为禾本科大麦属多年生草本植物, 具有较强的抗寒和耐盐碱能力, 是挖掘抗逆基因的优良种质资源。但目前尚未见野大麦遗传转化体系的报道。该研究以蒙农1号杂交野大麦成熟胚为外植体诱导愈伤组织, 建立了野大麦高效组培快繁体系, 分化率达70%, 快繁系数为35。在此基础上, 利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105菌株侵染筛选获得的高质量愈伤系YZ101, 通过优化侵染条件使侵染率接近30%。该体系的建立为野大麦功能基因组研究与分子设计育种奠定了基础。

关键词: 野大麦, 组培, 成熟胚, 愈伤组织系, 农杆菌侵染

Abstract: Hordeum brevisubulatum is a perennial grass belonging to the genus Hordeum in the Poaceae with strong cold and salt-alkali tolerance, which is an excellent germplasm resource for mining stress resistance genes. However, there are few reports on the genetic transformation system in H. brevisubulatum. In this study, the mature embryos in wild barley (Mengnong 1 hybrid) seeds were employed as explants to induce high quality embryogenic calli. A highly efficient tissue culture system was established for Mengnong 1 hybrid wild barley with approximate 70% of differentiation rate and the propagation coefficient was 35. Furthermore, Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 was used to infect the wild barley callus line YZ101, and the infection efficiency was approximate 30% with optimized infection conditions. This study will facilitate gene function deciphering and developing novel germplasm in H. brevisubulatum through molecular design breeding.

Key words: Hordeum brevisubulatum, tissue culture, mature embryo, callus line, Agrobacterium infection

刘叶飞, 赵海霞, 姜希萍, 邱锐, 周昕越, 赵彦, 付春祥. 野大麦高效组培快繁及农杆菌介导的愈伤侵染体系建立. 植物学报, 2023, 58(3): 440-448.

Yefei Liu, Haixia Zhao, Xiping Jiang, Rui Qiu, Xinyue Zhou, Yan Zhao, Chunxiang Fu. Establishment of Highly Efficient Tissue Culture and Agrobacterium-mediated Callus Infection Systems for Hordeum brevisubulatum. Chinese Bulletin of Botany, 2023, 58(3): 440-448.

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图/表 8

图1 PANIC6D(B)载体示意图 LB: T-DNA区段左边界; OsAct1: 水稻启动子; hph: 潮霉素抗性筛选标记基因; PvUbi1: 柳枝稷启动子; GUSplus: 葡萄糖苷酸酶报告基因; ZmUbi1: 玉米启动子; ccdB: 致死基因; RB: T-DNA区段右边界

Figure 1 Schematic diagram of PANIC6D(B) carrier LB: Left border of T-DNA; OsAct1: Rice promoter; hph: Screening marker gene for hygromycin resistance; PvUbi1: Switchgrass promoter; GUSplus: Glucosidase reporter gene; ZmUbi1: Maize promoter; ccdB: Lethal gene; RB: Right border of T-DNA

表1 不同消毒方法对野大麦种子诱导率的影响(平均值±标准误)

Table 1 Effect of different sterilization methods on seed induction rate of Hordeum brevisubulatum (means±SE)

Disinfection method		Disinfection time	Seed germination induction rate	Pollution rate
A (HgCl₂)		15 min	(61.3±4.0)%^ab	(4.0±3.6)%^b
B (NaClO)		15 min	(65.7±3.1)%^a	(5.3±1.5)%^b
C (H₂O₂)	C-1	4 h	(52.3±4.0)%^b	(33.3±1.5)%^a
	C-2	8 h	(34.0±2.7)%^bc	(4.3±1.5)%^b
	C-3	12 h	(20.1±3.1)%^d	(1.3±1.5)%^b

表2 不同浓度2,4-D对野大麦种子愈伤组织诱导率的影响(平均值±标准误)

Table 2 Effect of different 2,4-D concentrations on seed callus induction rate of Hordeum brevisubulatum (means±SE)

2,4-D concen- tration (mg·L^-1)	Seed induction rate	Callus status
2	(74.4±5.4)%^a	Loose and transparent vitrification callus
5	(65.0±3.6)%^b	Friable embryogenic callus with watery outer layer
7	(31.1±6.6)%^c	Compact and translucent watery callus

图2 不同浓度2,4-D (2 mg·L-1 (A)、5 mg·L-1 (B)和7 mg·L-1 (C))诱导的野大麦种子愈伤组织状态 (Bars=5 mm)

Figure 2 Seed callus status of Hordeum brevisubulatum induced by different concentrations of 2,4-D (2 mg·L-1 (A), 5 mg·L-1 (B) and 7 mg·L-1 (C)) (Bars=5 mm)

图3 野大麦种子愈伤组织系的筛选 (A)-(E) 不同愈伤组织系; (F)-(J) (A)-(E)对应放大图。Bars=5 mm

Figure 3 Selection of Hordeum brevisubulatum seed callus (A)-(E) Different calli; (F)-(J) Enlarged view of (A)-(E). Bars=5 mm

图4 野大麦胚性愈伤组织系的分化与生根 (A) 光照培养15天; (B) 光照培养25天; (C) 光照培养40天; (D) 生根; (E) 移栽

Figure 4 Differentiation and rooting of embryogenic callus of Hordeum brevisubulatum (A) 15 days’ culture in light; (B) 25 days’ culture in light; (C) 40 days’ culture in light; (D) Rooting; (E) Transplanting

图5 野大麦不同类型分化培养基的筛选横坐标代表不同类型的分化培养基, 其基础培养基为MS+ 2 mg·L-1 2,4-D+0.05 mg·L-1 KT, 在此基础上添加不同浓度梯度的蔗糖(30、40、50和60 g·L-1)以及phytagel (3.0、3.5和4.0 g·L-1)。S: 蔗糖; P: Phytagel。不同小写字母表示各处理间差异显著(单因素方差分析, Duncan’s检验, P<0.05)。

Figure 5 Screening of regeneration medium for Hordeum brevisubulatum The horizontal axis represents different types of regeneration medium. The medium composition includes MS+2 mg·L-1 2,4-D+0.05 mg·L-1 KT, and supplemented with different levels of sucrose (30, 40, 50 and 60 g·L-1) and phytagel (3.0, 3.5 and 4.0 g·L-1). S: Sucrose; P: Phytagel. Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments (One-way ANOVA, Duncan’s test, P<0.05).

图6 根癌农杆菌共培养时间对侵染效率的影响 (A)-(C) 共培养3、4和5天的GUS染色情况; (D)-(F) (A)、(B)和(C)中GUS染色阳性愈伤组织的对应放大图; (G) 侵染效率与共培养时间的关系。不同小写字母表示不同处理间差异显著(单因素方差分析, Duncan’s检验, P<0.05)。Bars=100 μm

Figure 6 Effect of co-culture time of Agrobacterium tumefaciens on infection efficiency (A)-(C) GUS staining of co-culture for 3, 4 and 5 days; (D)- (F) Enlarged view of GUS staining positive calli in (A), (B) and (C); (G) The relationship between infection efficiency and co-culture time. Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments (One-way ANOVA, Duncan’s test, P<0.05). Bars=100 μm

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