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发根农杆菌介导的野葛毛状根遗传转化体系
植物学报
2025, 60 (3):
425-434.
DOI: 10.11983/CBB24092
为建立高效的野葛(Pueraria lobata)毛状根遗传转化体系, 以野葛组培苗为外植体, 探讨不同因素对野葛毛状根遗传转化效率的影响。结果表明, 基因型是建立野葛毛状根高效遗传转化体系的主要限制因子; 发根农杆菌K599为最适宜的菌株; 以培养5-13代组培苗继代培养8天、第1-2节位刚展开的幼嫩叶片为最佳外植体材料, 预培养3天, 菌液侵染15分钟, 毛状根诱导率最高, 可达22.4%。野葛毛状根继代增殖的最佳培养基类型为固体培养基, 其毛状根鲜重是液体培养基中毛状根鲜重的75倍; PCR检测和荧光显微观察结果显示, GFP及rolB基因在野葛毛状根基因组中稳定表达, 共转化率为80%。研究初步建立了发根农杆菌介导的野葛毛状根遗传转化体系, 旨在为野葛基因功能研究奠定基础。
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图2
野葛毛状根诱导及继代培养
(A) 幼嫩叶片诱导产生的毛状根; (B) 叶柄诱导产生的毛状根; (C), (D) 继代培养的毛状根。Bars=1 cm
正文中引用本图/表的段落
不同基因型及不同外植体材料的毛状根诱导率如表2所示。YG-18和YG-50的不同部位外植体均无法成功诱导毛状根; 除YG-19外, 其余2个基因型的外植体毛状根诱导率均较低; 3个不同基因型(YG-19、YG-51和YG-81)的幼嫩叶片和叶柄均可成功诱导毛状根(图2A, B), 而老叶、茎段和茎尖均无法诱导毛状根。发根农杆菌K599侵染YG-19的不同外植体后, 随着培养时间的推移, 叶片和叶柄发生了一系列变化, 基部开始变厚并形成愈伤组织, 最初为乳白色, 后期部分愈伤组织发生褐化。侵染14天左右, 在乳白色的愈伤组织部位形成不定根。YG-51野葛品种的叶柄对发根农杆菌更加敏感, 其毛状根诱导率较嫩叶高。以YG-19刚展开的幼嫩叶片为外植体时毛状根的诱导率最高(为10.2%)。因此, 野葛毛状根诱导的最佳外植体材料为YG-19组培苗刚展开的幼嫩叶片。
不同部位幼嫩叶片对毛状根诱导效率影响较大, 未完全展开的幼嫩叶片诱导率最低(仅2.3%), 显著低于不同部位刚展开的幼嫩叶片诱导率(表4; 图2A)。以第1-2节位刚展开的幼嫩叶片毛状根诱导率最高(为18.1%), 相比3-4节位和5-6节位叶片诱导率增幅分别为69.2%和229.1%。且1-2节位刚展开的幼嫩叶片产生毛状根的时间仅为11天, 分别比未完全展开的幼嫩叶片、3-4节位以及5-6节位刚展开的幼嫩叶片出根时间减少3天、1天和3天; 诱导密度相比未完全展开的幼嫩叶片、3-4节位以及5-6节位刚展开的幼嫩叶片增幅分别为96.03%、14.45%和60.98%。因此, 以第1-2节位刚展开的幼嫩叶片为最佳外植体材料。
不同继代次数组培苗幼嫩叶片其毛状根诱导效率具有显著差异(表8; 图2C, D), 即不同继代次数也是影响野葛毛状根诱导的重要因素之一。随着继代次数的增加, 诱导率呈现先升高后降低趋势, 当组培苗继代次数≥21代时, 幼嫩叶片无法成功诱导野葛毛状根。外植体为第1代组培苗叶片时, 其诱导率仅为2.2%, 第3代组培苗叶片的诱导率显著增加, 增幅达404.5%。第5-13代组培苗叶片毛状根诱导率差异不显著, 诱导率基本稳定在16%左右, 诱导密度也保持在1.8-2.1之间。因此, 以继代培养5-13代组培苗幼嫩叶片为最佳外植体材料。
本文的其它图/表
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