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发根农杆菌介导的野葛毛状根遗传转化体系
植物学报
2025, 60 (3):
425-434.
DOI: 10.11983/CBB24092
为建立高效的野葛(Pueraria lobata)毛状根遗传转化体系, 以野葛组培苗为外植体, 探讨不同因素对野葛毛状根遗传转化效率的影响。结果表明, 基因型是建立野葛毛状根高效遗传转化体系的主要限制因子; 发根农杆菌K599为最适宜的菌株; 以培养5-13代组培苗继代培养8天、第1-2节位刚展开的幼嫩叶片为最佳外植体材料, 预培养3天, 菌液侵染15分钟, 毛状根诱导率最高, 可达22.4%。野葛毛状根继代增殖的最佳培养基类型为固体培养基, 其毛状根鲜重是液体培养基中毛状根鲜重的75倍; PCR检测和荧光显微观察结果显示, GFP及rolB基因在野葛毛状根基因组中稳定表达, 共转化率为80%。研究初步建立了发根农杆菌介导的野葛毛状根遗传转化体系, 旨在为野葛基因功能研究奠定基础。
表2
不同基因型及不同外植体对野葛毛状根诱导效率的影响
正文中引用本图/表的段落
取培养15天不同品系(YG-18、YG-19、YG-50、YG-51和YG-81)野葛的组培苗。取第2-3节位幼嫩叶, 将叶柄和茎剪成长度约为5 mm的小段, 在MS固体培养基上预培养2天后置于K599侵染液中, 振荡培养15分钟后将外植体取出。在无菌滤纸上晾干至表面无明显菌液后转入MS固体培养基上共培养2天, 然后转入配方为MS+100 mg·mL?1头孢噻肟钠(cef)的毛状根诱导培养基上暗培养, 每隔7天用相同培养基转接1次, 待外植体产生不定根后, 将其转入相同培养基, 在无植物生长调节剂的培养基上正常继代增殖且水平生长即为毛状根。30天后统计毛状根的诱导率。每个处理接种4皿, 每皿接种20个外植体, 重复3次。
不同基因型及不同外植体材料的毛状根诱导率如表2所示。YG-18和YG-50的不同部位外植体均无法成功诱导毛状根; 除YG-19外, 其余2个基因型的外植体毛状根诱导率均较低; 3个不同基因型(YG-19、YG-51和YG-81)的幼嫩叶片和叶柄均可成功诱导毛状根(图2A, B), 而老叶、茎段和茎尖均无法诱导毛状根。发根农杆菌K599侵染YG-19的不同外植体后, 随着培养时间的推移, 叶片和叶柄发生了一系列变化, 基部开始变厚并形成愈伤组织, 最初为乳白色, 后期部分愈伤组织发生褐化。侵染14天左右, 在乳白色的愈伤组织部位形成不定根。YG-51野葛品种的叶柄对发根农杆菌更加敏感, 其毛状根诱导率较嫩叶高。以YG-19刚展开的幼嫩叶片为外植体时毛状根的诱导率最高(为10.2%)。因此, 野葛毛状根诱导的最佳外植体材料为YG-19组培苗刚展开的幼嫩叶片。
外植体经过短时间的预培养, 有助于增强其适应性, 便于切口处的细胞进行自我修复, 进而激发植物组织细胞增殖, 维持其旺盛的生长活力。而处于分裂期的细胞更利于质粒整合外源T-DNA, 从而提高外源基因的转化效率(陈友明等, 2017)。在一定范围内, 随着预培养时间的增加, 毛状根诱导率上升, 进而获得最佳预培养时间, 培养时间过长反而影响毛状根的诱导率(付春祥等, 2004; 施和平等, 2017)。本研究表明, 野葛外植体叶片不经过预培养, 毛状根诱导率极低(仅2.1%); 最佳预培养时间为3天, 随着预培养时间的继续延长, 毛状根诱导率降低。
本文的其它图/表
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