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基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术研究进展及其在植物中的应用

何晓玲, 刘鹏程, 马伯军, 陈析丰

植物学报 2022, 57 (4): 508-531. DOI: 10.11983/CBB22020

摘要（1990）

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CRISPR/Cas9技术是利用RNA靶向引导Cas9核酸酶对基因组中的目标基因进行编辑的生物技术。近年来, 该技术的多种新型基因编辑器更新迅猛, 编辑效果愈加精细和高效, 在作物定向分子设计育种中展现出巨大的应用前景。该文对CRISPR/Cas9及其相关编辑器的技术原理、编辑效果和应用情况进行综述, 并探讨了该技术在应用中面临的问题、应对措施和发展前景, 旨在为相关领域的科研工作者提供参考。

编辑技术	编辑器	脱氨酶/逆转录酶		Cas蛋白	PAM (5′-3′)		活性窗口	编辑类型		特点	参考文献
胞嘧啶碱基编辑(CBEs)	BE3	rAPOBEC1		nCas9^D10A	NGG		C₄-C₈	C:G>T:A		实现C>T替换, 无需DSB或提供模板	Komor et al., 2016
	nCas9-PBE	rAPOBEC1		nCas9^D10A	NGG		C₃-C₉			在植物中实现精准高效的C>T替换	Zong et al., 2017
	Target-AID	PmCDA1		nCas9^D10A	NGG		C₁-C₅			具有较好的GC碱基编辑能力	Nishida et al., 2016
	dCas9-AIDx	hAID		dCas9	NCN		C₄-C₉			具有较好的GC碱基编辑能力	Ma et al., 2016
	A3A^Y130F- CBE_V01 A3A^Y130F- CBE_V04	hAPOBEC3A^Y130F		nCas9^D10A	NGG		C₄-C₁₅			活性窗口拓宽至12 nt	Ren et al., 2021a
	eCDAL	LjCDA1L-4		nCas9^D10A	NGG		C₁-C₁₂			活性窗口拓宽至12 nt	Xu et al., 2021
	BE3-PAPAPAP	rAPOBEC1		nCas9^D10A	NGG		C₅-C₆			活性窗口缩小至1-2 nt	Tan et al., 2019
	PhieCBEs	evorAPOCBEC1 evoFERNY evoCDA1 hA3A		nCas9-NG eCas9n- NG	NG NGG		C_-1-C₁₅			编辑窗口广	Zeng et al., 2020
	BE3^R126E BE3^R132E YE1-BE3	rAPOBEC1^R126E rAPOBEC1^R132E rAPOBEC1^W90Y+R126E		nCas9^D10A	NGG		C₅-C₇			脱靶率显著降低	Zuo et al., 2020
腺嘌呤碱基编辑(ABEs)	ABE7.10	ecTadA:ecTadA^*		nCas9^D10A	NGG		A₄-A₇	A:T>G:C		实现A>G替换, 无需DSB或提供模板	Gaudelli et al., 2017
	PABE	ecTadA:ecTadA^*		nCas9^D10A	NGG		A₄-A₈			在植物中实现精准高效的A>G替换	Li et al., 2018b
	ABE-Ps	ecTadA:ecTadA^*		nCas9^D10A SaCas9	NGG NNNRRT		A₁-A₁₅			在植物中实现精准高效的A>G替换	Hua et al., 2018
	rBE14	ecTadA:ecTadA^*		nCas9^D10A	NGG		A₅-A₇			荧光检测编辑植株	Yan et al., 2018
	rABE8e	TadA8e^V106W		nCas9^D10A nCas9-NG	NG NGG		A₅-A₆			极高的靶点编辑效率和碱基纯合替换效率	Wei et al., 2021
	PhieABEs	TadA8e		nCas9-NG SpGn SpRYn	NG NGN NNN		A₁-A₁₄			编辑效率高, 几近无PAM靶向, 窗口广	Tan et al., 2022
	SpRY-ABE8e	ecTadA:ecTadA^*		nCas9^D10A	NNN		A₃-A₁₀			几近无PAM靶向	Ren et al., 2021b
	ABE7.10^F148A	ecTadA^F148A: ecTadA^*F148A		nCas9^D10A	NGG		A₅-A₆			活性窗口缩小至1-2 nt	Zhou et al., 2019
CG碱基编辑(GBEs)	GBE	AID rAPOBEC1		nCas9^D10A	NGG		C₃-C₇	C:G>A:T/G:C		实现嘧啶与嘌呤间的颠换	Zhao et al., 2021
CG碱基编辑(GBEs)	CGBE	rAPOBEC1		nCas9^D10A	NGG		C₅-C₆	C:G>A:T/G:C		实现嘧啶与嘌呤间的颠换	Chen et al., 2021
双碱基编辑(A&CBE)	A&C-BEmax	hAID ecTadA:ecTadA^*		nCas9^D10A	NGG		C₂-C₁₇ A₄-A₇	C:G>T:A A:T>G:C		实现A、C共编辑	Zhang et al., 2020
	Target-ACE	PmCDA1 ecTadA:ecTadA^*			NGG		C₁-C₁₀ A₄-A₈				Sakata et al., 2019
	SPACE	PmCDA1 ecTadA^*			NGG		C₂-C₇ A₄-A₇				Grünewald et al., 2020
	ACBE	PmCDA1 ecTadA:ecTadA^*			NGG		C₁-C₇ A₄-A₆				Xie et al., 2020
	STEME	hAPOBEC3A ecTadA:ecTadA^*			NG NGD		C₁-C₁₇ A₄-A₈			在植物中实现A、 C共编辑	Li et al., 2020a
	pDuBE1	TadA8e			NGG		C₁-C₁₀ A₂-A₉			在植物中实现A、 C共编辑	Xu et al., 2021
编辑技术	编辑器		脱氨酶/逆转录酶	Cas蛋白	PAM (5′-3′)	活性窗口			编辑类型	特点	参考文献
先导编辑(PEs)	PE		M-MLV RT	nCas9^H840A	NGG	1-50			12种碱基替换插入(<15 bp) 缺失(<40 bp)	不受PAM的距离限制	Anzalone et al., 2019
	PPE		CaMV RT Retron RT							在植物中实现PE 应用	Lin et al., 2020
	pPE2		M-MLV RT							在植物中实现PE 应用	Xu et al., 2020a
	ePPE		M-MLV RT^{∆RNase H} M-MLV RT:NC			1-92			12种碱基替换插入(<40 bp) 缺失(<100 bp)	提高了在植物中的编辑效率	Zong et al., 2022
多重编辑	SWISSs		rAPOBEC1 ecTadA:ecTadA^*	nCas9^D10A	NG	C₃-C₁₆ A₄-A₇			C:G>T:A A:T>G:C Indels	具有A>G、C>T和Indels三重编辑功能	Li et al., 2020b
片段删除编辑	AFIDs		hAPOBEC3A hAPOBEC3Bctd	Cas9	NGG	C₁-C₁₄			多核苷酸删除	精准高效、可预测的多核苷酸缺失	Wang et al., 2020

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表1 各类碱基编辑器的特点

正文中引用本图/表的段落

由于CRISPR/Cas9需要产生DSB进行基因编辑, 因此具有一定的局限性, 因为NHEJ产生的突变是不定向的, 无法高效地获得预期的突变, 而HDR虽然可借助“人工模板”进行定向突变, 但其编辑效率非常低(Symington and Gautier, 2011)。因此, CRISPR/ Cas9技术在基因敲除中能高效应用, 只需造成基因移码突变就能破坏其编码蛋白的功能, 但对基因序列的定向改造或插入预设序列的效果并不理想, 大大限制了其应用范围。于是, 研究人员不断地对CRISPR/ Cas9系统进行改造, 如对Cas9蛋白的功能结构域进行突变, 引入不同类型的碱基脱氨酶, 开发出各类碱基编辑器(base editor, BE), 如胞嘧啶碱基编辑(cytidine BE, CBE)、腺嘌呤碱基编辑(adenine BE, ABE)和CG碱基编辑器(C-to-G BE, GBE) (表1), 可以对PAM 5'端的原间隔序列范围内的4- -10 nt (也称编辑活性窗口(activity windows))进行有效的碱基替换(substitution)或颠换(transversion), BE的定向突变率是HDR的10-100倍(Yeh et al., 2018)。同时, 为了弥补BE的碱基编辑类型有限以及不能引入预期的小片段插入或缺失(insertion or deletion, Indel), 还开发出先导编辑(prime editor, PE)、多重编辑(simultaneous and wide-editing induced by a single system, SWISS)和片段删除编辑(APOBEC-Cas9 fusion-induced deletion system, AFID)等新技术(表1), 从而实现对靶基因高效率、高精度和高需求的编辑。

N表示C、A、G、T四种碱基. ...

In vivo base editing of post-mitotic sensory cells

2018

... 由于CRISPR/Cas9需要产生DSB进行基因编辑, 因此具有一定的局限性, 因为NHEJ产生的突变是不定向的, 无法高效地获得预期的突变, 而HDR虽然可借助“人工模板”进行定向突变, 但其编辑效率非常低(Symington and Gautier, 2011).因此, CRISPR/ Cas9技术在基因敲除中能高效应用, 只需造成基因移码突变就能破坏其编码蛋白的功能, 但对基因序列的定向改造或插入预设序列的效果并不理想, 大大限制了其应用范围.于是, 研究人员不断地对CRISPR/ Cas9系统进行改造, 如对Cas9蛋白的功能结构域进行突变, 引入不同类型的碱基脱氨酶, 开发出各类碱基编辑器(base editor, BE), 如胞嘧啶碱基编辑(cytidine BE, CBE)、腺嘌呤碱基编辑(adenine BE, ABE)和CG碱基编辑器(C-to-G BE, GBE) (表1), 可以对PAM 5'端的原间隔序列范围内的4- -10 nt (也称编辑活性窗口(activity windows))进行有效的碱基替换(substitution)或颠换(transversion), BE的定向突变率是HDR的10-100倍(Yeh et al., 2018).同时, 为了弥补BE的碱基编辑类型有限以及不能引入预期的小片段插入或缺失(insertion or deletion, Indel), 还开发出先导编辑(prime editor, PE)、多重编辑(simultaneous and wide-editing induced by a single system, SWISS)和片段删除编辑(APOBEC-Cas9 fusion-induced deletion system, AFID)等新技术(表1), 从而实现对靶基因高效率、高精度和高需求的编辑. ...

PhieCBEs: plant high-efficiency cytidine base editors with expanded target range

2020

... Characteristics of all kinds of base editors

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