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基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术研究进展及其在植物中的应用

何晓玲, 刘鹏程, 马伯军, 陈析丰

植物学报 2022, 57 (4): 508-531. DOI: 10.11983/CBB22020

摘要（1994）

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CRISPR/Cas9技术是利用RNA靶向引导Cas9核酸酶对基因组中的目标基因进行编辑的生物技术。近年来, 该技术的多种新型基因编辑器更新迅猛, 编辑效果愈加精细和高效, 在作物定向分子设计育种中展现出巨大的应用前景。该文对CRISPR/Cas9及其相关编辑器的技术原理、编辑效果和应用情况进行综述, 并探讨了该技术在应用中面临的问题、应对措施和发展前景, 旨在为相关领域的科研工作者提供参考。

物种		品种	靶基因	转化方法	编辑技术	脱氨酶/逆转录酶		编辑类型	编辑窗口	编辑效率(%)		参考文献
水稻(Oryza sativa)		中花11	CDC48 NRT1.1B-T1	农杆菌AGL1	CBEs	hAPOBEC3A		C:G>T:A	C₂-C₁₆	44.1- 82.9		Zong et al., 2018
		日本晴	CDC48	农杆菌AGL1		rAPOBEC1		C:G>T:A	C₃-C₈	43.48		Zong et al., 2017
		Kitaake	Pi-d2 FLS2	农杆菌EHA105		hAID^*Δ		C:G>T:A	C₃-C₇	30.8-57		Ren et al., 2018
		中花11	ACC-T1 ALS-T1 CDC48-T3 DEP1-T1/2 NRT1.1B-T1	农杆菌AGL1	ABEs	ecTadA: ecTadA^*		A:T>G:C	A₄-A₈	15.8- 59.1		Li et al., 2018b
		日本晴	SPL14/16/17/18 SLR1	农杆菌EHA105		ecTadA: ecTadA^*		A:T>G:C	A₅-A₁₄	12.5- 61.3		Hua et al., 2018
		Kitaake	SERK2 WRKY45	农杆菌EHA105		ecTadA: ecTadA^*		A:T>G:C	A₄-A₇	32.05- 62.26		Yan et al., 2018
		中花11	ACC	农杆菌AGL1	STEMEs	hAPOBEC3A ecTadA: ecTadA^*		C:G>T:A; A:T>G:C	C₁-C₁₇ A₄-A₈	3.84		Li et al., 2020a
		中花11	CDC48-T1 ALS-T2	农杆菌EHA105	PEs	M-MLV		G:C>T:A 插入(≤3 bp) 删除(≤6 bp)	N₁-N₆	2.6-21.8		Lin et al., 2020
		日本晴	ALS-1/2 ACC-1 DEP1	农杆菌EHA105	PEs	M-MLV		C:G>T:A A:T>G:C G:C>T:A G:C>C:G G:C>A:T T:A>A:T A:T>C:G	N₁₈-N₃₃	1.7-26		Xu et al., 2020b
物种	品种		靶基因	转化方法	编辑技术	脱氨酶/逆转录酶	编辑类型		编辑窗口	编辑效率(%)	参考文献
	中花11		ALS-T2 ACC-T2 BADH-indels	农杆菌AGL1	SWISS	hAPOBEC3A ecTadA: ecTadA^*	C:G>T:A A:T>G:C C:G>G:C 删除(≤45 bp)		C₆-C₇ A₄-A₇	7.3	Li et al., 2020b
	中花11		CDC48-T2 SPL14 SWEET14	农杆菌AGL1	AFID	hAPOBEC3A	删除(≤16 bp)		C₂-C₁₇	22.2- 55.8	Wang et al., 2020
小麦(Triticum aestivum)	Kenong 199		ALS MTL	基因枪	CBEs	hAPOBEC3A	C:G>T:A		C_-9-C₁₃	16.7- 22.5	Zong et al., 2018
	Bobwhite		LOX2-S1	基因枪	CBEs	rAPOBEC1	C:G>T:A		C₃-C₉	1.25	Zong et al., 2017
	Kenong 199		ALS	基因枪	CBEs	rAPOBEC1	C:G>T:A		C_-1-C₇	22-78	Zhang et al., 2019
	Kenong 199		DEP1 GW2	基因枪	ABEs	ecTadA: ecTadA^*	A:T>G:C		A₅-A₈	0.4-1.1	Li et al., 2018a
	Kenong 199		miR396 GASR6	基因枪	AFID	hAPOBEC3A	删除(≤35 bp)		C_-12-C₂₃	25-37.5	Wang et al., 2020
番茄(Solanum lycopersicum)	WVA106		ALS1	农杆菌C58 pGV2260	CBEs	PmCDA1	C:G>T:A		C₇	34.7	Veillet et al., 2019
	WVA106		ALS1	农杆菌C58 pGV2260	CBEs	PmCDA1	C:G>T:A		C₁-C₈	20.59	Veillet et al., 2020
	Micro- Tom		DELLA	农杆菌	CBEs	PmCDA1	C:G>T:A		C₁-C₃	50.5	Shimatani et al., 2017
马铃薯 (S. tuberosum)	Désirée		GBSS1 DMR6-1	PEG	CBEs	hAPOBEC3A	C:G>T:A		C₃-C₁₀	8-16.67	Veillet et al., 2020
	Désirée		GBSS-T6	PEG	CBEs	hAPOBEC3A	C:G>T:A		C₁-C₁₃	6.5	Jiang et al., 2022
	Désirée		ALS1	农杆菌C58 pGV2260	CBEs	PmCDA1	C:G>T:A		C₁-C₈	25	Veillet et al., 2019
大豆 (Glycine max)	Jack		FT2a FT4	农杆菌	CBEs	rAPOBEC1	C:G>T:A		C₆-C₇	5.88- 18.2	Cai et al., 2020
棉花(Gossypium hirsutum)	Jin668		CLA PEBP	农杆菌GV3101	CBEs	rAPOBEC1	C:G>T:A		C₄-C₈	26.67- 57.78	Qin et al., 2020
玉米 (Zea mays)	Zong31		CENH3	农杆菌AGL1	CBEs	rAPOBEC1	C:G>T:A		C₃-C₈	10.1	Zong et al., 2017
玉米 (Zea mays)	ND73		ALS1/2	农杆菌LBA4404/ pVS1-VIR2	PEs	CmYLCV	C:G>T:A A:T>C:G T:A>G:C T:A>C:G C:G>A:T G:C>T:A G:C>A:T G:C>C:G		N₃-N₄₆	6.5-53.2	Jiang et al., 2020
油菜(Brassica napus)	J9712		ALS1	农杆菌	CBEs	rAPOBEC1	C:G>T:A		C₅-C₇	1.8	Wu et al., 2020
西瓜(Citrullus lanatus)	ZG94		ALS	农杆菌EHA105	CBEs	rAPOBEC1	C:G>T:A		C₇-C₈	23	Tian et al., 2018

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表2 碱基编辑器在作物中的应用

正文中引用本图/表的段落

CRISPR/Cas9基因编辑技术自诞生以来, 凭借其无与伦比的编辑优势, 迅速成为生物学领域中的强大工具。相较于作物的传统育种方式, 基因编辑育种具有精准、高效、成本低和周期短等多方面优点, 且其本质上类似于辐射或化学诱变育种, 但又能实现定向设计的分子育种。目前已成功在水稻、小麦、番茄(Solanum lycopersicum)、玉米、大豆(Glycine max)和甘蓝型油菜(Brassica napus)等多种作物中取得了较好的应用(表2)。CRISPR/Cas9基因编辑技术以前所未有的速度和效率打破了传统育种的瓶颈, 它凭借精准的编辑引入功能性突变, 删除产生不良性状的基因序列, 从而改良作物品质, 增强作物抗病能力, 提高其抗逆性与产量, 甚至可对野生种质资源进行从头驯化(de novo domestication) (谭禄宾和孙传清, 2021)。

然而, 直接敲除易感基因会导致植物损失部分内源功能基因, 影响植物的正常生长, 因此通过敲除易感基因使植株获得抗病能力并不是最理想的方式。而利用BEs对基因进行单碱基编辑, 可以在避免敲除基因的同时, 介导功能基因的表达变化, 例如, 通过BEs介导水稻FLS2基因的单碱基替换, 对其Ala948位点进行Asp或Glu替换, 使FLS2激酶结构域发生改变, 能促使水稻对病原性细菌产生更强的免疫反应; 同样通过单碱基突变, 还可以介导显隐性抗病基因之间的转化, 例如, 在水稻隐性基因pi-d2第441位氨基酸上引入G>A突变(M441I), 使其转化为显性抗性等位基因Pi-d2, 从而恢复其稻瘟病R基因的生物学功能(Ren et al., 2018)。

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