基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术研究进展及其在植物中的应用 植物学报    2022, 57 (4): 508-531.   DOI: 10.11983/CBB22020

图5 CRISPR干扰系统的工作原理
(A) dCas9阻止RNA聚合酶(RNAP)结合基因启动子, sgRNA介导dCas9结合目的基因启动子, 使RNAP (红色)无法与该基因启动子结合并进行转录; (B) dCas9阻断RNAP的转录延伸, sgRNA介导dCas9结合目的基因开放阅读框(ORF), 使RNAP无法继续转录延伸; (C) 转录抑制子阻止RNAP结合基因启动子, dCas9与转录抑制子(灰色)融合, 抑制子会阻止RNAP与目的基因启动子的结合; (D) 阻遏结合域(RBD)阻止目的基因的转录激活, dCas9与RBD (棕色)融合, RBD阻断转录因子(TFs)与目的基因的结合, 并与TFs结合形成强阻遏物抑制基因的转录表达。PAM: 原间隔序列邻近基序

正文中引用本图/表的段落

在Cas9蛋白的HNH和RuvC结构域分别引入H840A和D10A突变, 得到的nCas9D10A和nCas9H840A仅切割ssDNA, 而在2个结构域同时引入两类突变, 可得到无切割活性的核苷酸缺陷型Cas9 (dCas9)。dCas9在sgRNA引导下仍能与目的基因启动子(promoter)或开放阅读框(open reading frame, ORF)精确结合, 产生类似于“位阻”的效果, 阻碍RNA聚合酶(RNA polymerase, RNAP)与目的基因启动子的结合, 或阻断该基因的转录延伸(图5A,B), 这种新型的CRISPR/Cas9系统被称为CRISPR干扰系统(CRISPR interference, CRISPRi) (Qi et al., 2013)。将转录抑制子(suppressor)或阻遏结合域(repressor binding domain, RBD)与dCas9融合, 抑制子可阻止RNAP与基因结合, 而RBD则会结合转录因子(transcription factors, TFs)并形成强阻遏物, 阻断TFs结合和激活目基因的表达, 进而有效增强CRISPRi的靶向阻遏能力(图5C, D)。例如, Piatek等(2015)将转录抑制子EAR的抑制结构域(SRDX)融入dCas9的C端, 与单独的dCas9相比, dCas9:SRDX靶向本氏烟草

本文的其它图/表

• 表1 各类碱基编辑器的特点
  
• 图1 单(CBE、ABE、GBE)、双(A&C-BEmax)碱基编辑器工作原理
  (A) BE3介导的C>T替换(在nCas9^D10A (蓝色)、胞苷脱氨酶rAPOBEC1 (红色)和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI) (绿色)的作用下, 系统BE3将活性窗口中的C脱氨成U, 诱导细胞启动DNA修复实现C到T的替换; 红色三角形表示切口处); (B) ABE7.10介导的A>G替换(在腺苷脱氨酶ecTadA:ecTadA^* (黄色和橙色)的作用下, 系统ABE7.10将活性窗口中的A脱氨成I, 并在DNA修复后实现A到G的替换); (C) A&C-BEmax介导的C>T与A>G共替换(在胞嘧啶脱氨酶hAID (红色)、ecTadA:ecTadA^*和2个UGI的作用下, 系统A&C-BEmax诱导DNA修复, 实现C到T、A到G的同时替换); (D) GBE介导的C>G颠换(在尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG) (深蓝)的作用下, UNG将C脱氨生成的U水解为AP位点, 并在DNA修复后实现C到G的颠换)。PAM: 原间隔序列邻近基序
  
• 图2 先导编辑器(PE)的工作原理
  在nCas9^H840A (绿)和逆转录酶M-MLV (黄)的作用下, 系统PE将碱基序列连接到靶位点, 借助DNA修复实现任意碱基的转换以及小片段的插入或删除。PAM: 原间隔序列邻近基序; PBS: 引物结合位点
  
• 图3 多重编辑系统(SWISS)的工作原理
  (A), (B) SWISS系统使用不同的scRNAs (MS2和boxB), 招募融合了相应蛋白(MCP和N22p)的rAPOBEC1或ecTadA:ecTadA^*, 实现同时在不同位点的胞嘧啶碱基编辑(CBE)和腺嘌呤碱基编辑(ABE); (C) 使用1对sgRNA在第3个靶点产生DNA双链断裂(DSB), 诱导细胞进行同源定向修复(HDR), 产生随机突变。PAM: 原间隔序列邻近基序; UGI: 尿嘧啶糖基化酶抑制剂
  
• 图4 多核苷酸靶向删除系统(AFID)的工作原理
  Cas9切割双链产生双链断裂(DSB), 尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG)将C脱氨生成的U水解为AP位点, 并借助AP裂合酶(橙红色)和核酸外切酶(棕色), 实现靶点C到DSB切口之间的多核苷酸删除。PAM: 原间隔序列邻近基序
  
• 图6 CRISPR激活系统的工作原理
  (A) 转录激活子激活目的基因转录, dCas9与转录激活子(洋红色)融合, 招募RNA聚合酶(RNAP)并激活目的基因的转录; (B)-(E) 不同CRISPRa系统示意图, 包括TALs (橙红色)、VP64 (绿色)、MS2 (浅黄色)、MCP (深黄色)、GCN4 (湛蓝色)和scFv (明黄色)。PAM: 原间隔序列邻近基序
  
• 图7 基因组修饰系统去甲基化和甲基化的工作原理
  (A) DNA去甲基化修饰, dCas9-SunTag系统招募人脱甲基酶TET1cd (棕色), 在目的基因的启动子区使DNA去甲基化, Me表示甲基化; (B) DNA甲基化修饰, dCas9-SunTag系统招募烟草DRM甲基转移酶催化结构域NtDRMcd (绿色), 在目的基因启动子区使DNA甲基化。PAM: 原间隔序列邻近基序
  
• 表2 碱基编辑器在作物中的应用