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铁观音原生质体高效瞬时转化方法的建立
植物学报
2022, 57 (3):
340-349.
DOI: 10.11983/CBB21206
近年来, 茶树基因组测序的完成为茶树在分子和基因水平的研究奠定了基础。但由于转基因技术尚不成熟且茶树生长周期较长, 茶树的基因功能研究依然不能有效开展。采用铁观音(Camellia sinensis var. sinensis cv. ‘Tieguanyin’)实生幼苗叶片, 通过筛选多种纤维素酶、果胶酶、离析酶和甘露醇的浓度组合, 并结合原生质体的数量、活性和杂质含量综合确定了最佳配方, 成功建立了铁观音茶苗叶片原生质体提取和PEG介导的高效瞬时转化体系, 转化率达56.25%。利用该系统探索了茶氨酸代谢通路中2个重要合成酶(茶氨酸合成酶(TSI)和谷氨酰胺合成酶(GSII-1.1))的亚细胞定位。研究发现, 这2种酶均定位于铁观音原生质体细胞质中。茶苗叶片原生质体提取和瞬时转化体系的建立为茶树基因组功能研究奠定了技术基础。  View image in article
图2
采用聚乙二醇(PEG)诱导HBT-TCP20-GFP质粒在拟南芥和铁观音叶肉原生质体中转化
(A)-(D) Bars=200 μm
正文中引用本图/表的段落
PEG介导的瞬时转化是利用PEG使Mn2+、Mg2+和Ca2+等二价离子及DNA在细胞表面形成沉淀, 并改变细胞膜透性, 使DNA进入细胞中, 达到瞬时转化的目的。该方法操作简单, 用时短, 可用于基因定位及瞬时表达等研究, 是目前原生质体转化实验的常用方法。TCP家族是植物中特有的一类转录因子, 在拟南芥和茶树中保守(Martín-Trillo and Cubas, 2010; Zhang et al., 2021a)。本研究以拟南芥为对照, 用9号酶解液配方提取铁观音幼叶原生质体, 选用在细胞核富集表达的HBT-TCP20-GFP质粒, 通过PEG- 4000介导原生质体转化。每个实验重复3次, 每次统计300个以上的原生质体, 计算平均值和标准差。结果(图2)表明, 采用40%PEG-4000诱导拟南芥原生质体转化5分钟, 培养过夜后, 转化率均值为68.13%, 最高可达86.74%。而采用40%PEG-4000诱导铁观音幼叶原生质体转化30分钟, 培养过夜后, 转化效率均值为52.56%, 最高可达56.25% (图2)。
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