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铁观音原生质体高效瞬时转化方法的建立
植物学报
2022, 57 (3):
340-349.
DOI: 10.11983/CBB21206
近年来, 茶树基因组测序的完成为茶树在分子和基因水平的研究奠定了基础。但由于转基因技术尚不成熟且茶树生长周期较长, 茶树的基因功能研究依然不能有效开展。采用铁观音(Camellia sinensis var. sinensis cv. ‘Tieguanyin’)实生幼苗叶片, 通过筛选多种纤维素酶、果胶酶、离析酶和甘露醇的浓度组合, 并结合原生质体的数量、活性和杂质含量综合确定了最佳配方, 成功建立了铁观音茶苗叶片原生质体提取和PEG介导的高效瞬时转化体系, 转化率达56.25%。利用该系统探索了茶氨酸代谢通路中2个重要合成酶(茶氨酸合成酶(TSI)和谷氨酰胺合成酶(GSII-1.1))的亚细胞定位。研究发现, 这2种酶均定位于铁观音原生质体细胞质中。茶苗叶片原生质体提取和瞬时转化体系的建立为茶树基因组功能研究奠定了技术基础。
表3
GSII-1.1和TSI基因引物序列
正文中引用本图/表的段落
选取长势良好的当年生铁观音实生苗第1叶, 按照RNA提取试剂盒(成都福际)说明书提取茶树叶片总RNA。采用Promega公司的反转录试剂盒, 按照说明书进行反转录。采用Snapgene软件设计GSII-1.1和TSI基因引物(表3)。PCR产物经回收和酶切后, 选用T4 DNA ligase进行目的片段与载体HBT-GFP-HA连接(Xiong and Sheen, 2012)。将上述测序正确的质粒进行CsCl方法质粒大提(Yoo et al., 2007), 为后续原生质体转化做准备。
本文的其它图/表
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