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铁观音原生质体高效瞬时转化方法的建立

张玉琴, 吴嘉诚, 何萌, 刘仁义, 朱晓玥

植物学报 2022, 57 (3): 340-349. DOI: 10.11983/CBB21206

摘要（1926）

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近年来, 茶树基因组测序的完成为茶树在分子和基因水平的研究奠定了基础。但由于转基因技术尚不成熟且茶树生长周期较长, 茶树的基因功能研究依然不能有效开展。采用铁观音(Camellia sinensis var. sinensis cv. ‘Tieguanyin’)实生幼苗叶片, 通过筛选多种纤维素酶、果胶酶、离析酶和甘露醇的浓度组合, 并结合原生质体的数量、活性和杂质含量综合确定了最佳配方, 成功建立了铁观音茶苗叶片原生质体提取和PEG介导的高效瞬时转化体系, 转化率达56.25%。利用该系统探索了茶氨酸代谢通路中2个重要合成酶(茶氨酸合成酶(TSI)和谷氨酰胺合成酶(GSII-1.1))的亚细胞定位。研究发现, 这2种酶均定位于铁观音原生质体细胞质中。茶苗叶片原生质体提取和瞬时转化体系的建立为茶树基因组功能研究奠定了技术基础。

Reagent name	Amount (10 mL)
PEG-4000	4 g
1 mol·L^-1 CaCl₂	2 mL
0.8 mol·L^-1 D-mannitol	2.5 mL
ddH₂O	2 mL

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表2 聚乙二醇(PEG)诱导铁观音原生质体转化试剂用量

正文中引用本图/表的段落

在细胞培养六孔板的每个孔内加入1 mL WI溶液(0.5 mol·L-1甘露醇, 4 mmol·L-1 MES, 20 mmol·L-1 KCl), 待用。取20 μL (1 μg·μL-1) HBT-TCP20-GFP质粒、200 μL (4×104个细胞)原生质体、220 μL 40% PEG-4000 (试剂配比见表2), 置于2 mL圆底管中。用手指轻轻拨动圆底管, 使三者充分混合。室温下反应30分钟后, 加入1 mL W5溶液终止反应, 252 ×g离心2分钟, 弃上清。在圆底管中加入100 μL W5溶液重悬细胞, 将原生质体吸入预先加入WI溶液的六孔板的1个孔中, 置于22°C恒温培养箱, 光照条件下培养12小时, 然后在荧光显微镜下观察。

原生质体转化步骤: 吸取200 μL拟南芥原生质体(约4×104个细胞), 加入20 μL HBT-TCP20-GFP质粒, 再加入220 μL 40% PEG-4000 (试剂配比见表2)诱导转化5分钟。加入1 mL W5溶液终止反应, 然后252 ×g离心2分钟。吸去上清, 加入100 μL W5溶液, 转移至含有1 mL WI溶液的六孔板, 于22°C恒温培养箱, 光照培养12小时后在荧光显微镜下观察转化结果。

利用茶树原生质体瞬时转化技术, 通过超高分辨率超高灵敏度激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM880)观察拟南芥及铁观音幼叶原生质体中茶氨酸合成酶TSI和谷氨酰胺合成酶GSII-1.1的亚细胞定位情况(图4A-P)。结果表明, 拟南芥及铁观音幼叶原生质体中转化的2种酶均定位在细胞质中, 与预测的茶氨酸合成酶的生化功能相吻合。

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