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铁观音原生质体高效瞬时转化方法的建立

张玉琴, 吴嘉诚, 何萌, 刘仁义, 朱晓玥

植物学报 2022, 57 (3): 340-349. DOI: 10.11983/CBB21206

摘要（1926）

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近年来, 茶树基因组测序的完成为茶树在分子和基因水平的研究奠定了基础。但由于转基因技术尚不成熟且茶树生长周期较长, 茶树的基因功能研究依然不能有效开展。采用铁观音(Camellia sinensis var. sinensis cv. ‘Tieguanyin’)实生幼苗叶片, 通过筛选多种纤维素酶、果胶酶、离析酶和甘露醇的浓度组合, 并结合原生质体的数量、活性和杂质含量综合确定了最佳配方, 成功建立了铁观音茶苗叶片原生质体提取和PEG介导的高效瞬时转化体系, 转化率达56.25%。利用该系统探索了茶氨酸代谢通路中2个重要合成酶(茶氨酸合成酶(TSI)和谷氨酰胺合成酶(GSII-1.1))的亚细胞定位。研究发现, 这2种酶均定位于铁观音原生质体细胞质中。茶苗叶片原生质体提取和瞬时转化体系的建立为茶树基因组功能研究奠定了技术基础。

Treatment number	Yield (10⁶·g^-1 FW)	Viability (%)
1	1.58±1.22	40.69±29.05
2	1.95±0.77	80.53±1.74
3	0.38±0.04	65.31±14.40
4	0.66±0.33	65.49±10.50
5	1.54±0.76	64.16±6.39
6	2.04±1.01	75.38±2.56
7	0.60±0.31	71.06±15.20
8	2.09±0.70	72.01±12.55
9	1.83±0.51	70.19±2.09

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表4 不同酶解液配方下铁观音幼叶原生质体产量与活性(平均值±标准差)

正文中引用本图/表的段落

通过改变酶解液中纤维素酶、果胶酶、离析酶及甘露醇的浓度配比, 进行铁观音幼叶原生质体提取试验, 筛选最佳配方。结果表明, 采用8号酶解液配方所提取的原生质体数量最多(2.09×106个·g-1 FW)。采用0.1%二乙酸荧光素(fluorescein diacetate, FDA)染色法对不同酶解液提取的原生质体进行活性检测, 发现2号酶解液配方所提取的原生质体活性最高(达80.53%) (表4)。采用9号酶解液配方所提取的原生质体较其它配方活性良好而且杂质含量最少(图1)。综合原生质体数量、活性及杂质含量考虑, 最终采用9号配方提取原生质体, 进行后续原生质体转化、亚细胞定位和功能研究。

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