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铁观音原生质体高效瞬时转化方法的建立
植物学报
2022, 57 (3):
340-349.
DOI: 10.11983/CBB21206
近年来, 茶树基因组测序的完成为茶树在分子和基因水平的研究奠定了基础。但由于转基因技术尚不成熟且茶树生长周期较长, 茶树的基因功能研究依然不能有效开展。采用铁观音(Camellia sinensis var. sinensis cv. ‘Tieguanyin’)实生幼苗叶片, 通过筛选多种纤维素酶、果胶酶、离析酶和甘露醇的浓度组合, 并结合原生质体的数量、活性和杂质含量综合确定了最佳配方, 成功建立了铁观音茶苗叶片原生质体提取和PEG介导的高效瞬时转化体系, 转化率达56.25%。利用该系统探索了茶氨酸代谢通路中2个重要合成酶(茶氨酸合成酶(TSI)和谷氨酰胺合成酶(GSII-1.1))的亚细胞定位。研究发现, 这2种酶均定位于铁观音原生质体细胞质中。茶苗叶片原生质体提取和瞬时转化体系的建立为茶树基因组功能研究奠定了技术基础。
表1
铁观音幼叶原生质体提取试剂配比
正文中引用本图/表的段落
根据文献及预试验结果, 拟定4个变量(纤维素酶、果胶酶、离析酶及甘露醇浓度) (表1), 探究铁观音原生质体提取的最佳配方。每个处理重复3次。
将铁观音实生幼苗在生长当年进行弱光培养。每日观察叶片生长状态, 以叶片露出芽记为第1天, 待该叶片长至10-15天时, 采摘叶片。在提取当日配置酶解液(表1), 称取纤维素酶、果胶酶、离析酶和甘露醇, 溶于20 mmol·L-1 KCl和20 mmol·L-1 MES, 在55°C水浴锅中加热10分钟, 以去除其它杂酶的干扰, 置于室温冷却后加入0.1% BSA和10 mmol·L-1 CaCl2, 补水定容至5 mL。
我们进一步比较了HBT-GFP-GSII-1.1和HBT-GFP- TSI质粒在拟南芥和铁观音原生质体的瞬时转化率(图3A, B)。结果表明, 在拟南芥原生质体中转化HBT- GFP-GSII-1.1和HBT-GFP-TSI质粒, 转化率均值分别为68.57%和12.55%, 最高分别可达83.42%和14.02%; 在铁观音幼叶原生质体中转化HBT-GFP- GSII-1.1和HBT-GFP-TSI质粒, 转化率均值分别为31.57%和14.91%, 最高分别可达32.28%和24.20%。不同表达载体的转化差异可能是由于基因自身的蛋白稳定性导致荧光强度存在差异。
基因功能研究是确定基因作用的主要环节之一。茶树基因组测序的完成为茶树植物的分子水平研究奠定了基础(Wei et al., 2018)。该研究预测茶氨酸合成酶TSI和谷氨酰胺合成酶GSII-1.1在茶树茶氨酸合成过程中发挥重要作用。由于茶树转基因技术尚不成熟, 因此只在拟南芥中间接对茶氨酸合成酶TSI进行功能验证, 但并未对谷氨酰胺合成酶GSII-1.1的功能进行验证。我们的研究进一步在铁观音茶苗的原生质体中进行了TSI和GSII-1.1的亚细胞定位, 发现与拟南芥中一致, TSI和GSII-11在铁观音中同样主要在细胞质中表达。此外, 我们还发现HBT-GFP-GSII-1.1在拟南芥中转化效率更高, 而HBT-GFP-TSI在铁观音中的转化效率更高。上述结果表明, GSII-1.1可能更容易在拟南芥中稳定表达, 而TSI则更容易在铁观音中稳定表达, 说明不同蛋白在茶树和拟南芥中的表达具有特异性。如能进一步在茶不同部位的原生质体中验证TSI和GSII-1.1的功能, 并测定相关瞬时转化原生质体中的茶氨酸含量, 可以更加深入解析这些基因在茶氨酸合成过程中的作用。
本文的其它图/表
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