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利用转基因毛状根高效培育大豆嵌合植株的方法
植物学报
2024, 59 (1):
89-98.
DOI: 10.11983/CBB23021
建立高效的大豆(Glycine max)转基因毛状根嵌合植株体系对于推动大豆功能基因组学研究具有重要意义。该研究利用3种大豆基因型材料比较了不同共培养条件下毛状根诱导率及成活率。结果显示, 用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染外植体并在黑暗条件下共培养1天是诱导毛状根形成的有效策略。研究发现清除下胚轴处不定根可显著增加毛状根的数目并促进根系生长, 进而提高转基因毛状根的阳性率。毛状根诱导14天接种根瘤菌, 可增强生长初期转基因毛状根与根瘤菌的接触, 从而提高大豆的结瘤效率。该研究成功建立了一种高效培育大豆转基因毛状根嵌合植株的方法, 可广泛应用于大豆基因功能研究。  View image in article
图1
发根农杆菌诱导大豆下胚轴转基因毛状根产生嵌合植株流程
(A) 萌发4天后的大豆幼苗(bar=2 cm); (B) 在下胚轴处以45°角切开形成伤口(bar=1 cm); (C) 从培养皿中收集发根农杆菌(bar=1 cm); (D) 在伤口处涂菌(bar=1 cm); (E) 共培养(bar=1 cm); (F) 将外植体移入蛭石中(bar=5 cm); (G) 培养10天后诱导出愈伤组织(bar=1 cm); (H) 诱导14天后毛状根形成(bar=1 cm); (I) 毛状根生长20天后的状态(bar=2 cm); (J) I图的局部放大(bar=2 cm)
正文中引用本图/表的段落
挑选饱满的大豆种子播种在蛭石中, 萌发4天后子叶尚未分开(图1A), 用刀片在幼苗下胚轴处以45°角切开形成伤口(图1B), 同时收集携带pTF102载体的K599农杆菌(图1C), 涂抹于伤口处(图1D), 将经20分钟高温高压灭菌的滤纸平铺在托盘上, 用10 mL灭菌水浸湿滤纸, 将幼苗伤口朝上放在托盘中共培养(图1E), 随后将大豆植株转移至含有蛭石的双层钵中诱导毛状根(图1F), 利用棉线将营养液容器与装有蛭石的容器相连, 通过棉线自动吸收营养液。10天后伤口形成愈伤组织(图1G), 14天后明显可见毛状根形成(图1H), 20天后, 毛状根大量生长且嵌合植株形成三出复叶(图1I, J)。
(A), (D) 不清理(A)与清理(D)不定根的大豆嵌合植株(bars= 2 cm); (B), (E) 分别为图A和D方框中的局部放大(bars=1 cm); (C), (F) 毛状根GUS染色(bars=1 cm)。红色箭头指示毛状根上的根瘤。AR同
利用一步法建立大豆嵌合植株体系具有诸多优势。(1) 缩短了毛状根诱导时间。用下胚轴注射法需要2-3周才能长出毛状根(Kereszt et al., 2007), 而利用一步法, 生长7天的幼苗在农杆菌侵染后16天, 毛状根长至(24.27±8.76) cm (Fan et al., 2020)。本研究用萌发4天的幼苗(图1)诱导20天, 每个嵌合植株平均长出14.9条毛状根(图3B), 毛状根平均长度为14.08 cm (图2C)。由于每条转基因毛状根代表一个独立的转化事件, 因此诱导效率明显增高。(2) 操作简单, 省时省力, 适合高通量实验。下胚轴注射法需使用注射器在下胚轴处制造伤口, 再埋入生长介质中, 同时利用透气的透明袋罩住植株以保持湿度, 每天喷水直至长出毛状根, 操作步骤相对繁琐, 费时费力。相比而言, 用一步法可直接在下胚轴处切割形成伤口, 蘸取农杆菌直接完成侵染, 共培养后移入介质中, 整个毛状根诱导过程通过双层钵装置自动吸水(图1F),无需浇水, 只需在诱导前期向植物表面每天喷水2次。(3) 加快根瘤形成, 有助于开展结瘤相关实验。下胚轴注射法由于毛状根诱导时间延长, 导致地上部生物量较大, 同时主根一般在毛状根生长至5-10 cm时去除, 常表现头重脚轻, 嵌合植株不易成活(Guo et al., 2011; Yang et al., 2021)。此外, 下胚轴注射法需进行缓苗后再接种根瘤菌, 大大降低了结瘤效率(Li et al., 2015, 2018)。然而, 利用一步法在毛状根诱导14天时(毛状根刚长出)接种根瘤菌, 生长至20-30天, 根瘤已清晰可见(图4)。此时, 地上部第1片三出复叶刚刚展开(图4A, D), 植株较小, 可进一步调整培养方案, 如通过水培进行不同养分处理, 观察根瘤发育及其对地上部新生叶片和生物量的影响。
本文的其它图/表
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