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利用转基因毛状根高效培育大豆嵌合植株的方法

陈佳欣, 梅浩, 黄彩翔, 梁宗原, 全依桐, 李东鹏, 布威麦尔耶姆·赛麦提, 李欣欣, 廖红

植物学报 2024, 59 (1): 89-98. DOI: 10.11983/CBB23021

摘要（452）

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建立高效的大豆(Glycine max)转基因毛状根嵌合植株体系对于推动大豆功能基因组学研究具有重要意义。该研究利用3种大豆基因型材料比较了不同共培养条件下毛状根诱导率及成活率。结果显示, 用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染外植体并在黑暗条件下共培养1天是诱导毛状根形成的有效策略。研究发现清除下胚轴处不定根可显著增加毛状根的数目并促进根系生长, 进而提高转基因毛状根的阳性率。毛状根诱导14天接种根瘤菌, 可增强生长初期转基因毛状根与根瘤菌的接触, 从而提高大豆的结瘤效率。该研究成功建立了一种高效培育大豆转基因毛状根嵌合植株的方法, 可广泛应用于大豆基因功能研究。

Treatments	Genotype	Co-cultivation time (d)	Efficiency of induction (%)	Number of chimeric plant with HR	Surviving rate (%)	Number of surviving plants	Total number of plants
Dark	Ws82	0	87.0	20	76.7	23	30
		1	96.2	25	86.7	26	30
		3	89.7	26	96.7	29	30
	HN66	0	87.5	21	80.0	24	30
		1	95.7	22	76.7	23	30
		3	83.3	15	60.0	18	30
	BX10	0	93.3	14	75.0	15	20
		1	94.7	18	95.0	19	20
		3	82.4	14	85.0	17	20
Light (100 µmol∙m^-2∙s^-1)	Ws82	0	82.4	21	76.7	23	30
Light (100 µmol∙m^-2∙s^-1)		1	91.3	21	76.7	23	30
		3	68.2	15	73.3	22	30
	HN66	0	90.0	18	66.7	20	30
		1	83.3	20	80.0	24	30
		3	90.5	19	70.0	21	30
	BX10	0	86.7	13	75.0	15	20
		1	83.3	15	90.0	18	20
		3	80.0	12	75.0	15	20

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表1 不同基因型大豆在光/暗条件下毛状根(HR)形成的对比

正文中引用本图/表的段落

用农杆菌侵染大豆下胚轴后, 进行共培养并设置黑暗及100 μmol?m-2?s-1光照处理。其中共培养0天表示侵染农杆菌后, 直接移入双层钵中, 在相应光、暗条件下培养1天, 随后置于400 μmol?m-2?s-1光下培养; 而共培养1天和3天表示侵染农杆菌后放在上述托盘中覆盖保鲜膜保湿, 在相应光、暗条件下分别培养1天和3天, 再移入双层钵中进行400 μmol?m-2?s-1光照培养; 每天喷水2次, 保湿。毛状根诱导20天, 收获大豆嵌合植株, 计算诱导率, GUS染色后统计阳性率。

大豆下胚轴接种农杆菌时未保留主根, 植株能否成活是转基因毛状根嵌合植株体系成功建立的关键。因此, 我们比较了不同基因型及共培养条件下植株成活情况及毛状根诱导率。结果表明, 不同基因型大豆均能通过农杆菌侵染下胚轴诱导形成毛状根(表1)。然而, 不同共培养条件对植株成活率和毛状根诱导率影响不同。其中, 黑暗条件下, 成活率最低(75.0%)的处理为BX10未经过共培养直接移入蛭石中黑暗培养1天, 成活率最高可达96.7% (Ws82共培养3天); 在100 μmol?m-2?s-1光照条件下, HN66未经共培养的成活率最低(66.7%), BX10共培养1天成活率达90.0%。说明发根农杆菌侵染大豆下胚轴后, 进行共培养和适当黑暗处理以减少蒸腾, 对植株成活具有重要作用。

进一步比较毛状根诱导率, 结果表明, 黑暗条件下不同基因型大豆与农杆菌共培养时毛状根诱导率在82.4%-96.2%之间, 但同一基因型材料均在共培养1天时毛状根诱导率达到最高值, Ws82、HN66及BX10的诱导率分别为96.2%、95.7%和94.7% (表1)。在100 μmol?m-2?s-1光照条件下, 只有Ws82在共培养1天时诱导率最高(91.3%), 其它2种基因型共培养时间对毛状根诱导率均未产生明显影响, 诱导率在80.0%-90.5%之间。上述结果表明, 黑暗处理且下胚轴与农杆菌共培养1天是不同基因型大豆诱导形成毛状根的最优措施。

不同基因型大豆的毛状根诱导率、毛状根数目及转化效率存在差异(李锦锦等, 2012)。本研究利用3种大豆基因型进行不同共培养条件的比较, 结果表明3种基因型大豆均能通过一步法建立毛状根嵌合植株体系, 且诱导效率均达80.0%以上(表1)。黑暗条件下外植体与农杆菌共培养1天的优化处理使3种基因型毛状根诱导率达94.7%以上, 是毛状根诱导较优的共培养条件。此外, 利用一步法诱导毛状根的过程中, 会产生大量不定根(Fan et al., 2020)。本研究表明, 清理不定根2次的优化处理方式对毛状根诱导数目和生长均具有明显的促进作用, 进而间接影响转基因毛状根的阳性率(图2, 图3)。因此, 本研究优化了大豆毛状根嵌合植株体系。

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