利用转基因毛状根高效培育大豆嵌合植株的方法 植物学报    2024, 59 (1): 89-98.   DOI: 10.11983/CBB23021

图2 清理下胚轴处的不定根对毛状根诱导的影响
(A) 不清理与清理不定根条件下毛状根生长对比(bars=1 cm); (B) 每条毛状根生长的侧根数目; (C) 根长; (D) 根表面积; (E) 根平均直径。数据为25个毛状根的平均值±标准差。***表示在0.001水平差异显著。AR: 不定根; HR: 毛状根

正文中引用本图/表的段落

(A) 萌发4天后的大豆幼苗(bar=2 cm); (B) 在下胚轴处以45°角切开形成伤口(bar=1 cm); (C) 从培养皿中收集发根农杆菌(bar=1 cm); (D) 在伤口处涂菌(bar=1 cm); (E) 共培养(bar=1 cm); (F) 将外植体移入蛭石中(bar=5 cm); (G) 培养10天后诱导出愈伤组织(bar=1 cm); (H) 诱导14天后毛状根形成(bar=1 cm); (I) 毛状根生长20天后的状态(bar=2 cm); (J) I图的局部放大(bar=2 cm)

当去掉主根时, 植物将形成大量不定根以保持存活。本研究表明, 在诱导毛状根时, 植株下胚轴处长出大量不定根。为了明确不定根是否影响毛状根的诱导与生长, 本研究同时设计了清理不定根(CAR)的处理。以Ws82为材料, 黑暗条件下共培养1天后, 移入双层钵中诱导毛状根, 每周清理1次, 共清理2次后, 第3周收获嵌合植株并观察毛状根的生长状况, 以未清理不定根(NCAR)的处理为对照。结果表明, 不定根存在与否对下胚轴愈伤组织的诱导无明显影响, 即2种处理均能诱导长出毛状根, 然而, NCAR处理显著抑制毛状根的生长(图2A)。进一步分析发现, 与对照相比, CAR条件下, 单条毛状根的侧根数增加了773.1% (图2B), 毛状根平均长度、根系表面积和根系平均直径分别增高161.4%、213.9%和25.5% (图2C-E)。结果表明, 大豆转基因毛状根嵌合植株体系的建立需要定期清理不定根。

(A), (D) 不清理(A)与清理(D)不定根的大豆嵌合植株(bars= 2 cm); (B), (E) 分别为图A和D方框中的局部放大(bars=1 cm); (C), (F) 毛状根GUS染色(bars=1 cm)。红色箭头指示毛状根上的根瘤。AR同图2。

利用一步法建立大豆嵌合植株体系具有诸多优势。(1) 缩短了毛状根诱导时间。用下胚轴注射法需要2-3周才能长出毛状根(Kereszt et al., 2007), 而利用一步法, 生长7天的幼苗在农杆菌侵染后16天, 毛状根长至(24.27±8.76) cm (Fan et al., 2020)。本研究用萌发4天的幼苗(图1)诱导20天, 每个嵌合植株平均长出14.9条毛状根(图3B), 毛状根平均长度为14.08 cm (图2C)。由于每条转基因毛状根代表一个独立的转化事件, 因此诱导效率明显增高。(2) 操作简单, 省时省力, 适合高通量实验。下胚轴注射法需使用注射器在下胚轴处制造伤口, 再埋入生长介质中, 同时利用透气的透明袋罩住植株以保持湿度, 每天喷水直至长出毛状根, 操作步骤相对繁琐, 费时费力。相比而言, 用一步法可直接在下胚轴处切割形成伤口, 蘸取农杆菌直接完成侵染, 共培养后移入介质中, 整个毛状根诱导过程通过双层钵装置自动吸水(图1F),无需浇水, 只需在诱导前期向植物表面每天喷水2次。(3) 加快根瘤形成, 有助于开展结瘤相关实验。下胚轴注射法由于毛状根诱导时间延长, 导致地上部生物量较大, 同时主根一般在毛状根生长至5-10 cm时去除, 常表现头重脚轻, 嵌合植株不易成活(Guo et al., 2011; Yang et al., 2021)。此外, 下胚轴注射法需进行缓苗后再接种根瘤菌, 大大降低了结瘤效率(Li et al., 2015, 2018)。然而, 利用一步法在毛状根诱导14天时(毛状根刚长出)接种根瘤菌, 生长至20-30天, 根瘤已清晰可见(图4)。此时, 地上部第1片三出复叶刚刚展开(图4A, D), 植株较小, 可进一步调整培养方案, 如通过水培进行不同养分处理, 观察根瘤发育及其对地上部新生叶片和生物量的影响。

不同基因型大豆的毛状根诱导率、毛状根数目及转化效率存在差异(李锦锦等, 2012)。本研究利用3种大豆基因型进行不同共培养条件的比较, 结果表明3种基因型大豆均能通过一步法建立毛状根嵌合植株体系, 且诱导效率均达80.0%以上(表1)。黑暗条件下外植体与农杆菌共培养1天的优化处理使3种基因型毛状根诱导率达94.7%以上, 是毛状根诱导较优的共培养条件。此外, 利用一步法诱导毛状根的过程中, 会产生大量不定根(Fan et al., 2020)。本研究表明, 清理不定根2次的优化处理方式对毛状根诱导数目和生长均具有明显的促进作用, 进而间接影响转基因毛状根的阳性率(图2, 图3)。因此, 本研究优化了大豆毛状根嵌合植株体系。

大豆能够与根瘤菌共生, 形成固氮根瘤, 源于其高效的固氮作用, 可为农业生态系统提供大量清洁氮源, 在环境友好型可持续农业中发挥不可替代的作用(Herridge et al., 2008; Qin et al., 2012; Hungria and Mendes, 2015)。因此, 大豆共生固氮的调控机制备受关注, 相关研究也取得较大进展(Li et al., 2020; Xu et al., 2021; Wang et al., 2021; Ke et al., 2022)。而转基因毛状根嵌合植株体系的建立具有重要贡献。与大豆根系不同, 毛状根没有向地性, 且在毛状根诱导过程中, 根瘤菌更易侵染不定根而形成根瘤, 暗示除根系结构存在差异外, 不定根与毛状根在根瘤菌互作中可能存在竞争关系。基于此, 本研究比较了清理与不清理不定根对毛状根结瘤的影响, 发现清理不定根后促进了大豆结瘤, 根瘤数目及发育明显优于未清理不定根处理(图4; 表2)。其主要原因二方面可能是清理不定根促进了毛状根生长(图2), 从而使根系优先接触介质中的根瘤菌, 进而先形成根瘤。因此, 从种子萌发到可见转基因根瘤耗时仅30-35天, 大幅提高了大豆结瘤效率。另一方面, 由于2种根系本身的区别可能导致根系招募根瘤菌的能力及根瘤菌识别等存在差异。虽然2种根系最终均能形成根瘤, 但结瘤效率明显不同, 具体调控机制有待进一步研究。

本文的其它图/表

• 图1 发根农杆菌诱导大豆下胚轴转基因毛状根产生嵌合植株流程
  (A) 萌发4天后的大豆幼苗(bar=2 cm); (B) 在下胚轴处以45°角切开形成伤口(bar=1 cm); (C) 从培养皿中收集发根农杆菌(bar=1 cm); (D) 在伤口处涂菌(bar=1 cm); (E) 共培养(bar=1 cm); (F) 将外植体移入蛭石中(bar=5 cm); (G) 培养10天后诱导出愈伤组织(bar=1 cm); (H) 诱导14天后毛状根形成(bar=1 cm); (I) 毛状根生长20天后的状态(bar=2 cm); (J) I图的局部放大(bar=2 cm)
  
• 表1 不同基因型大豆在光/暗条件下毛状根(HR)形成的对比
  
• 图3 清理下胚轴处的不定根对毛状根阳性率的影响
  (A) 不清理与清理不定根条件下毛状根GUS染色, 椭圆形及箭头示非转基因毛状根(bars=1 cm); (B) 每个外植体产生的毛状根总数; (C) 每个外植体阳性毛状根数目; (D) 阳性率。数据为14个外植体的平均值±标准差。*和***分别表示在0.05和0.001水平差异显著。
  
• 图4 清理不定根对毛状根结瘤的影响
  (A), (D) 不清理(A)与清理(D)不定根的大豆嵌合植株(bars= 2 cm); (B), (E) 分别为图A和D方框中的局部放大(bars=1 cm); (C), (F) 毛状根GUS染色(bars=1 cm)。红色箭头指示毛状根上的根瘤。AR同图2。
  
• 表2 不清理与清理不定根对转基因毛状根根瘤数目的影响