利用转基因毛状根高效培育大豆嵌合植株的方法 植物学报    2024, 59 (1): 89-98.   DOI: 10.11983/CBB23021

图3 清理下胚轴处的不定根对毛状根阳性率的影响
(A) 不清理与清理不定根条件下毛状根GUS染色, 椭圆形及箭头示非转基因毛状根(bars=1 cm); (B) 每个外植体产生的毛状根总数; (C) 每个外植体阳性毛状根数目; (D) 阳性率。数据为14个外植体的平均值±标准差。*和***分别表示在0.05和0.001水平差异显著。

正文中引用本图/表的段落

对大豆转基因毛状根嵌合植株进行GUS染色, 并统计毛状根阳性率。结果发现, CAR处理的毛状根生长状况明显优于NCAR处理, 且多数毛状根表达GUS基因, 即GUS染色呈蓝色(图3A)。由于载体pTF102属于35S::GUS增强型启动子, 因此, 转基因毛状根染色孵育过夜后, 有些非转基因根系也吸附了蓝色(图3A)。数据分析发现, CAR处理的毛状根数目、阳性毛状根数目及阳性率均显著增高, 与NCAR处理相比, 分别增高35.9%、122.0%和66.5% (图3B-D)。说明在诱导毛状根期间, 定期清理不定根不仅促进毛状根生长, 增加毛状根数目, 而且能提高转基因阳性毛状根比例, 有助于转基因毛状根嵌合植株体系的建立。

利用一步法建立大豆嵌合植株体系具有诸多优势。(1) 缩短了毛状根诱导时间。用下胚轴注射法需要2-3周才能长出毛状根(Kereszt et al., 2007), 而利用一步法, 生长7天的幼苗在农杆菌侵染后16天, 毛状根长至(24.27±8.76) cm (Fan et al., 2020)。本研究用萌发4天的幼苗(图1)诱导20天, 每个嵌合植株平均长出14.9条毛状根(图3B), 毛状根平均长度为14.08 cm (图2C)。由于每条转基因毛状根代表一个独立的转化事件, 因此诱导效率明显增高。(2) 操作简单, 省时省力, 适合高通量实验。下胚轴注射法需使用注射器在下胚轴处制造伤口, 再埋入生长介质中, 同时利用透气的透明袋罩住植株以保持湿度, 每天喷水直至长出毛状根, 操作步骤相对繁琐, 费时费力。相比而言, 用一步法可直接在下胚轴处切割形成伤口, 蘸取农杆菌直接完成侵染, 共培养后移入介质中, 整个毛状根诱导过程通过双层钵装置自动吸水(图1F),无需浇水, 只需在诱导前期向植物表面每天喷水2次。(3) 加快根瘤形成, 有助于开展结瘤相关实验。下胚轴注射法由于毛状根诱导时间延长, 导致地上部生物量较大, 同时主根一般在毛状根生长至5-10 cm时去除, 常表现头重脚轻, 嵌合植株不易成活(Guo et al., 2011; Yang et al., 2021)。此外, 下胚轴注射法需进行缓苗后再接种根瘤菌, 大大降低了结瘤效率(Li et al., 2015, 2018)。然而, 利用一步法在毛状根诱导14天时(毛状根刚长出)接种根瘤菌, 生长至20-30天, 根瘤已清晰可见(图4)。此时, 地上部第1片三出复叶刚刚展开(图4A, D), 植株较小, 可进一步调整培养方案, 如通过水培进行不同养分处理, 观察根瘤发育及其对地上部新生叶片和生物量的影响。

不同基因型大豆的毛状根诱导率、毛状根数目及转化效率存在差异(李锦锦等, 2012)。本研究利用3种大豆基因型进行不同共培养条件的比较, 结果表明3种基因型大豆均能通过一步法建立毛状根嵌合植株体系, 且诱导效率均达80.0%以上(表1)。黑暗条件下外植体与农杆菌共培养1天的优化处理使3种基因型毛状根诱导率达94.7%以上, 是毛状根诱导较优的共培养条件。此外, 利用一步法诱导毛状根的过程中, 会产生大量不定根(Fan et al., 2020)。本研究表明, 清理不定根2次的优化处理方式对毛状根诱导数目和生长均具有明显的促进作用, 进而间接影响转基因毛状根的阳性率(图2, 图3)。因此, 本研究优化了大豆毛状根嵌合植株体系。

本文的其它图/表

• 图1 发根农杆菌诱导大豆下胚轴转基因毛状根产生嵌合植株流程
  (A) 萌发4天后的大豆幼苗(bar=2 cm); (B) 在下胚轴处以45°角切开形成伤口(bar=1 cm); (C) 从培养皿中收集发根农杆菌(bar=1 cm); (D) 在伤口处涂菌(bar=1 cm); (E) 共培养(bar=1 cm); (F) 将外植体移入蛭石中(bar=5 cm); (G) 培养10天后诱导出愈伤组织(bar=1 cm); (H) 诱导14天后毛状根形成(bar=1 cm); (I) 毛状根生长20天后的状态(bar=2 cm); (J) I图的局部放大(bar=2 cm)
  
• 表1 不同基因型大豆在光/暗条件下毛状根(HR)形成的对比
  
• 图2 清理下胚轴处的不定根对毛状根诱导的影响
  (A) 不清理与清理不定根条件下毛状根生长对比(bars=1 cm); (B) 每条毛状根生长的侧根数目; (C) 根长; (D) 根表面积; (E) 根平均直径。数据为25个毛状根的平均值±标准差。***表示在0.001水平差异显著。AR: 不定根; HR: 毛状根
  
• 图4 清理不定根对毛状根结瘤的影响
  (A), (D) 不清理(A)与清理(D)不定根的大豆嵌合植株(bars= 2 cm); (B), (E) 分别为图A和D方框中的局部放大(bars=1 cm); (C), (F) 毛状根GUS染色(bars=1 cm)。红色箭头指示毛状根上的根瘤。AR同图2。
  
• 表2 不清理与清理不定根对转基因毛状根根瘤数目的影响