大花银莲花愈伤组织诱导及再生体系的建立 植物学报    2022, 57 (2): 217-226.   DOI: 10.11983/CBB21200

图1 大花银莲花再生体系的建立
(A) 无菌苗; (B) 上胚轴诱导的不定芽; (C) 下胚轴诱导出的愈伤组织及不定芽; (D) 叶片诱导出的愈伤组织; (E) 叶片愈伤组织分化出的不定芽; (F) 叶柄诱导出的愈伤组织及分化的不定芽; (G) 不定芽的增殖; (H) 不定芽生根; (I) 移栽。Bars=2 cm

正文中引用本图/表的段落

待无菌幼苗长至3-7 cm高时(图1A), 取叶片, 用解剖刀在垂直于叶片主叶脉中央处横切2刀, 切口长度为1/2叶宽, 叶片反面朝上; 叶柄纵切至0.5-1 cm, 分别平放于添加不同浓度6-BA (0.5、1.0、2.0以及4.0 mg∙L-1)和NAA (0.1、0.3和0.5 mg∙L-1)的1/2MS诱导培养基上, 于室温22-25°C的组培室中黑暗培养20天, 之后在光周期为12小时光照/12小时黑暗下培养。选择长势一致的愈伤组织接种于不定芽分化培养基(6-BA浓度为0.5、1.0、2.0和4.0 mg∙L-1, NAA浓度为0.1和0.3 mg∙L-1)。每个处理15瓶, 每瓶接种4个, 重复3次。30天后观察并统计愈伤组织及不定芽的诱导情况。

在添加激素的各处理中, 上胚轴均先直接分化出不定芽, 之后在基部产生愈伤组织(图1B)。与CK (1/2MS)相比, 不同激素处理对大花银莲花上胚轴不定芽诱导的影响显著(表1)。当添加6-BA浓度一定时, 随着NAA浓度的升高, 不定芽的诱导率呈整体下降的趋势。当NAA浓度为0.1和0.2 mg∙L-1时, 诱导率较高, 且在2.0 mg∙L-1 6-BA+0.1 mg∙L-1 NAA处理下达到最高, 为96.67%, 但此时芽长势较为细弱; 在1.0 mg∙L-1 6-BA+0.1 mg∙L-1 NAA处理下, 不定芽的诱导率为86.67%, 且比其它处理生长速度快。诱导1周后, 上胚轴两端切口处开始膨大凸起。2周后, 不定芽基本分化整齐且生长健壮。综合考虑诱导率与不定芽长势, 上胚轴不定芽诱导的最佳培养基为1/2MS+1.0 mg∙L-1 6-BA+0.1 mg∙L-1 NAA。

此外, 与CK相比, 不同处理对下胚轴愈伤组织诱导的影响显著(表2)。当6-BA浓度为0.5以及1.0 mg∙L-1时, 随着NAA浓度的升高, 愈伤组织的诱导率呈先上升后下降; 当6-BA浓度为2.0 mg∙L-1时, NAA浓度为0.1、0.2以及1.0 mg∙L-1时, 愈伤组织的诱导率均为100%, 但是在0.2 mg∙L-1 NAA处理下, 愈伤组织多为黄白色, 并且表面的芽点较少, 而在1.0 mg∙L-1 NAA处理下, 愈伤组织的水渍化较为严重。因此, 下胚轴愈伤组织诱导的最佳培养基为1/2MS+2.0 mg∙L-1 6-BA+0.1 mg∙L-1 NAA, 此时愈伤组织多呈黄绿色, 且生长较为致密, 有颗粒感(图1C)。

激素种类及浓度对大花银莲花叶片和叶柄愈伤组织的诱导皆有一定影响, 添加不同激素的培养基中, 叶片受伤处均可诱导出愈伤组织(表3)。当6-BA浓度一定时, 随着NAA浓度的增加, 愈伤组织的诱导率呈先降低后上升; 当NAA浓度为0.1和0.3 mg∙L-1时, 随着6-BA浓度的升高, 愈伤组织的诱导率呈先上升后下降。在2.0 mg∙L-1 6-BA+0.1 mg∙L-1 NAA或4.0 mg∙L-1 6-BA+0.5 mg∙L-1 NAA处理下的愈伤组织诱导率最高, 均为100%, 但是前者处理下的愈伤组织生长速度较快, 培养的第1周叶片开始出现卷曲, 第2周伤口处开始膨大产生凸起, 第18天开始脱分化产生细小颗粒状的黄绿色愈伤组织, 1个月后表面出现质地紧密且具有芽点分布的愈伤组织。因此, 叶片愈伤组织的最佳诱导培养基为1/2MS+2.0 mg∙L-1 6-BA+0.1 mg∙L-1 NAA (图1D)。

未添加激素处理的叶柄均未诱导出愈伤组织。当6-BA浓度为0.5、1.0和2.0 mg∙L-1时, 随着NAA浓度的升高, 叶柄愈伤组织的诱导率呈整体降低的趋势; 在添加2.0 mg∙L-1 6-BA+0.1 mg∙L-1 NAA的培养基中, 叶柄愈伤组织的生长状态最好并且诱导率最高(为100%)。在此处理下, 叶柄先从两端切口处膨大, 第15天整个叶柄表面形成紧密状且质地较为硬实的黄绿色愈伤组织。因此, 叶柄愈伤组织的最佳诱导培养基为1/2MS+2.0 mg∙L-1 6-BA+0.1 mg∙L-1 NAA (图1F)。

此外, 未添加激素处理的叶片愈伤组织均未分化出不定芽(表4)。当NAA浓度为0.1 mg∙L-1时, 随着6-BA浓度的增加, 叶片不定芽的分化率逐渐升高; 当6-BA浓度一定时, 随着NAA浓度的增加, 叶片不定芽的分化率呈先上升后下降。在4.0 mg∙L-1 6-BA+ 0.1 mg∙L-1 NAA处理下, 叶片愈伤组织的分化率最高(为77.78%); 在2.0 mg∙L-1 6-BA+0.1 mg∙L-1 NAA处理下的分化率次之(为73.33%), 但此处理下的出芽数较多, 叶片呈深绿色且平展。因此, 叶片愈伤组织分化的最佳培养基为1/2MS+2.0 mg∙L-1 6-BA+0.1 mg∙L-1 NAA (图1E)。

叶柄愈伤组织分化过程中, 除CK外, 其它处理的叶柄愈伤组织均可分化出不定芽。当NAA浓度为0.1 mg∙L-1时, 随着6-BA浓度的增加, 叶柄不定芽的分化率逐渐升高; 当6-BA浓度为2.0和4.0 mg∙L-1时, 随着NAA浓度的增加, 不定芽的分化率逐渐降低。在4.0 mg∙L-1 6-BA+0.1 mg∙L-1 NAA处理下的分化率最高(为51.11%), 并且出芽数较高, 与除2.0 mg∙L-1 6-BA+0.1 mg∙L-1 NAA处理外的其它处理均差异显著(P<0.05)。因此, 大花银莲花叶柄愈伤组织分化的最佳培养基为1/2MS+4.0 mg∙L-1 6-BA+0.1 mg∙L-1 NAA (图1F)。

将不同外植体分化出的不定芽及其基部携带的愈伤组织接种于增殖培养基中, 发现同种外植体在不同激素处理下不定芽的增殖差异显著, 4种外植体平均增殖系数依次为: 上胚轴(2.58) >下胚轴(2.40) >叶片(2.31) >叶柄(1.89) (表5)。在相同培养条件及处理时间下, 不同类型外植体不定芽增殖速度排序同其不定芽平均增殖系数。其中, 上胚轴与叶片在1.0 mg∙L-1 6-BA+0.05 mg∙L-1 NAA处理下的不定芽增殖系数最高, 分别为3.89与3.66; 下胚轴在2.0 mg∙L-1 6-BA+ 0.1 mg∙L-1 NAA处理下的不定芽增殖系数最高, 为3.77; 叶柄则在4.0 mg∙L-1 6-BA+0.1 mg∙L-1 NAA处理下的不定芽增殖系数最高, 为3.22。同一种外植体在不同浓度6-BA与NAA组合处理下, 不定芽的增殖系数不同。当NAA浓度一定时, 随着6-BA浓度的增加上胚轴与下胚轴不定芽的增殖系数先升高后降低; 当6-BA浓度一定时, 随着NAA浓度的增加叶片与叶柄不定芽的增殖系数呈整体降低趋势, 呈现出高浓度NAA抑制不定芽增殖现象。综合不定芽增殖系数和增殖速度, 以上胚轴在1.0 mg∙L-1 6-BA+0.05 mg∙L-1 NAA处理下的效果最佳, 30天内, 上胚轴不定芽的增殖系数最高, 达到3.89, 此时不定芽茎粗, 叶色鲜绿, 芽的整体高度最高(图1G)。

选择增殖培养基上生长良好的不定芽接种于生根培养基, 发现培养基中添加不同种类及浓度的激素, 大花银莲花不定芽的生根表现出显著差异(表6)。不定芽在未添加任何激素的培养基中也能生根, 但根较短且极细。IBA处理下的不定芽生根率与IAA处理下的无显著差异, 其中添加0.3、1.2和2.0 mg∙L-1 IBA及0.6 mg∙L-1 IAA的培养基处理下生根率达到100%; 0.3 mg∙L-1 IBA处理下的平均生根条数最多, 根长最长。综合根及幼苗的生长状况, 大花银莲花不定芽的最佳生根诱导培养基为1/2MS+0.3 mg∙L-1 IBA (图1H)。

将生根的不定芽块炼苗移栽。不同栽培基质对大花银莲花组培苗的成活率有一定影响(表7)。在草炭:珍珠岩=3:1 (v/v)的培养基质中, 移栽成活率最低, 为50%; 在纯草炭基质中的移栽成活率最高, 为100%, 但苗长势一般; 在草炭:蛭石=2:1 (v/v)基质中的成活率为98.33%, 但苗长势较快, 叶色浓绿且健壮, 因此最适合大花银莲花组培苗生长的基质是草炭:蛭石= 2:1 (v/v) (图1I)。

本文的其它图/表

• 表1 不同植物生长调节剂处理对大花银莲花上胚轴不定芽诱导的影响
  
• 表2 不同植物生长调节剂处理对大花银莲花下胚轴愈伤组织诱导及不定芽分化的影响
  
• 表3 不同植物生长调节剂处理对大花银莲花叶片和叶柄愈伤组织诱导的影响
  
• 表4 不同植物生长调节剂处理对大花银莲花叶片和叶柄不定芽分化的影响
  
• 图2 大花银莲花不同外植体愈伤组织的平均分化率
  不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
  
• 表5 不同植物生长调节剂处理对大花银莲花不定芽增殖的影响
  
• 表6 不同植物生长调节剂处理对大花银莲花不定芽生根诱导的影响
  
• 表7 栽培基质对大花银莲花组培苗移栽的影响