P515的测量原理、方法和应用 植物学报    2021, 56 (5): 594-604.   DOI: 10.11983/CBB21052

图2 测量拟南芥叶绿体ATP合酶的质子传导性
拟南芥离体叶片在光强为500 μmol·m^-2·s^-1的活化光(635 nm)下照光10分钟, 照光期间提供稳定的CO₂ (380 μmol·mol^-1)、湿度(60%大气湿度)和温度(23°C)。检测黑暗250 ms的P515衰减动力学, 重复100次后取平均值。ATP合酶的质子传导率为P515衰减动力学曲线半衰期(t_1/2)的倒数, 即94.3·s^-1。箭头表示活化光关闭。

正文中引用本图/表的段落

当植物处于稳态的光合作用时, 通过光合电子传递引起的质子流入类囊体囊腔的速率与通过ATP合酶的质子流出速率相等(Sacksteder and Kramer, 2000)。DIRK (dark internal relaxation kinetics)技术是利用短暂的黑暗(<500 ms)干扰处于稳态光合的电子和质子流, 检测样品在520 nm处的光吸收(Sacksteder et al., 2000)。该方法可估算叶绿体ATP合酶的活性(Cruz et al., 2001)。其原理是当ATP合酶活性降低时, 通过ATP合酶的质子流出速率也会相应降低。拟南芥野生型在500 μmol·m-2·s-1的光照强度下, 叶绿体ATP合酶的质子传导率(g_H+)为94.3·s-1 (图2)。拟南芥bfa1和bfa3是两个ATP合酶突变体, 在不同光照强度下, 其g_H+分别下降至野生型的30%和50%, 同时均表现出较高的NPQ (Zhang et al., 2016, 2018)。这是因为当ATP合酶活性降低时, 通过ATP合酶的质子流出效率降低, 导致质子在类囊体囊腔累积, 囊腔过度酸化会抑制NPQ衰减, 从而表现出高水平的NPQ。烟草(Nicotiana tabacum) GTG-atpB突变体的g_H+降至野生型的25%, 且突变体的碳同化能力、线式电子传递速率和P700+再还原能力也显著降低(Rott et al., 2011)。P515与叶绿素荧光、P700氧化还原动力学的结合使用在烟草、玉米(Zea mays)、拟南芥和豌豆(Pisum sativum)等叶绿体ATP合酶突变体的表型筛选和功能研究方面发挥了重要作用(Rott et al., 2011; Zoschke et al., 2012; Fristedt et al., 2015; Sukhov et al., 2016; Zhang et al., 2016)。

本文的其它图/表

• 图1 饱和闪光诱导的P515快速动力学
  (A) 饱和闪光诱导的P515快速动力学示意图, 包括快速上升阶段(橙)、缓慢上升阶段(蓝)和缓慢下降阶段(绿), 箭头表示1次单周转饱和闪光(ST); (B) 饱和闪光诱导莱茵衣藻在520-550 nm的快速吸收变化(单周转饱和闪光波长635 nm, 光强200000 μmol·m^-2·s^-1, 持续时间5 μs), 莱茵衣藻野生型(WT) (浓度约25 μg·mL^-1)加入(红)和不加入(黑) 10 µmol·L^-1二氯苯基二甲脲(DCMU)和1 mmol·L^-1羟胺(HA), 测量前莱茵衣藻暗适应20分钟; (C) 预照光对P515快速动力学的影响, 莱茵衣藻野生型在暗适应20分钟(黑)以及在光下持续照光2分钟(光强40 μmol·m^-2·s^-1), 黑暗1分钟(红)后的P515快速动力学。
  
• 图3 测量莱茵衣藻围绕PSI的环式电子传递速率
  莱茵衣藻野生型(WT)和PGR5突变体(Mutant)在光强为80 μmol·m^-2·s^-1的活化光(635 nm)下照光5分钟, 关光后检测围绕PSI的环式电子传递速率, 黑暗持续时间为250 ms。测量前, 藻细胞(浓度约25 μg·mL^-1)加入10 µmol·L^-1二氯苯基二甲脲(DCMU)、1 mmol·L^-1羟胺(HA)和20%的聚蔗糖, 暗适应20分钟。箭头表示活化光关闭。
  
• 图4 拟南芥质子动力势(pmf)及其组分(ΔΨ和ΔpH)的测定
  拟南芥离体叶片在光强为100 μmol·m^-2·s^-1 (WT 100, 黑)和750 μmol·m^-2·s^-1 (WT 750, 红)的活化光(635 nm)下照光3分钟, 照光期间提供稳定的CO₂ (380 μmol·mol^-1)、湿度(60%大气湿度)和温度(23°C)。黑暗时间60秒, 曲线为3次重复的平均值。测量前, 拟南芥叶片暗适应至少3小时。向上箭头表示活化光打开, 向下箭头表示活化光关闭。
  
• 图5 同步测量莱茵衣藻P515信号和叶绿素荧光
  将莱茵衣藻野生型(浓度约30 μg·mL^-1)暗适应20分钟, 放入荧光仪的测量室, 分别打开P515/535模块和叶绿素荧光模块的测量光, 测定初始荧光产量(F_o)。打开饱和闪光(635 nm, 6000 μmol·m^-2·s^-1, 持续时间250 ms), 测定黑暗状态下的最大荧光产量(F_m)。之后打开活化光(635 nm, 1500 μmol·m^-2·s^-1), 持续照光140秒, 期间每隔60秒施加1次饱和闪光, 测定光下最大荧光产量(F_m′)。活化光关闭后测定质子动力势(pmf)及其组分(ΔΨ和ΔpH), 与此同时每隔60秒施加1次饱和闪光, 检测黑暗状态下的荧光产量是否恢复到最大荧光产量(F_m)。F_o: 初始荧光产量; F_m: 最大荧光产量; F_m′: 光下最大荧光产量; F_s: 稳态荧光产量; Actinic light: 活化光; Saturating pulse: 饱和闪光; pmf: 质子动力势; ΔΨ: 跨膜电势; ΔpH: 跨膜质子梯度