P515的测量原理、方法和应用 植物学报    2021, 56 (5): 594-604.   DOI: 10.11983/CBB21052

图1 饱和闪光诱导的P515快速动力学
(A) 饱和闪光诱导的P515快速动力学示意图, 包括快速上升阶段(橙)、缓慢上升阶段(蓝)和缓慢下降阶段(绿), 箭头表示1次单周转饱和闪光(ST); (B) 饱和闪光诱导莱茵衣藻在520-550 nm的快速吸收变化(单周转饱和闪光波长635 nm, 光强200000 μmol·m^-2·s^-1, 持续时间5 μs), 莱茵衣藻野生型(WT) (浓度约25 μg·mL^-1)加入(红)和不加入(黑) 10 µmol·L^-1二氯苯基二甲脲(DCMU)和1 mmol·L^-1羟胺(HA), 测量前莱茵衣藻暗适应20分钟; (C) 预照光对P515快速动力学的影响, 莱茵衣藻野生型在暗适应20分钟(黑)以及在光下持续照光2分钟(光强40 μmol·m^-2·s^-1), 黑暗1分钟(红)后的P515快速动力学。

正文中引用本图/表的段落

计算2个光系统反应中心比值的常规方法是将细胞破碎后进行密度梯度离心, 得到PSI和PSII的组分或者通过免疫印迹法进行定量分析, 而检测P515可活体、快速地得到准确的实验结果。在毫秒级尺度内, 单周转饱和闪光会诱导植物515 nm处的光吸收发生快速变化, 即P515快速动力学, 以此计算PSI和PSII反应中心的比值。P515快速动力学包括3个过程: 快速上升阶段、缓慢上升阶段和缓慢下降阶段(图1A)。快速上升阶段指暗适应的样品, 其PSI和PSII反应中心完全开放, 单周转饱和闪光(ST)会诱导2个光反应中心发生原初电荷分离, 从而引起515 nm处光吸收快速增加, 增幅反映有活性的PSI和PSII反应中心的数量(莱茵衣藻野生型快速上升阶段的幅度为2.24×103 ΔI/I (图1B)。当在样品中加入DCMU和HA完全抑制PSII的光合活性后, 单周转饱和闪光仅诱导PSI反应中心发生1次电荷分离, 得到PSI反应中心的数量(此时莱茵衣藻野生型快速上升阶段的幅度为1.13×103 ΔI/I (图1B), 进而获得2个光反应中心数量的比值(约1.02)。P515信号快速上升之后有一个较慢的上升相, 即慢速上升阶段, 反映由原初电荷分离产生的电子在2个光系统之间的传递, 与Cytb₆f处的醌循环有关。饱和闪光关闭后, 由快速上升和缓慢上升阶段产生的跨膜电势消失, 这是由质子通过ATP合酶外流引起(Schreiber and Klughammer, 2008; Bailleul et al., 2010; Viola et al., 2019)。

(A) 饱和闪光诱导的P515快速动力学示意图, 包括快速上升阶段(橙)、缓慢上升阶段(蓝)和缓慢下降阶段(绿), 箭头表示1次单周转饱和闪光(ST); (B) 饱和闪光诱导莱茵衣藻在520-550 nm的快速吸收变化(单周转饱和闪光波长635 nm, 光强200000 μmol·m-2·s-1, 持续时间5 μs), 莱茵衣藻野生型(WT) (浓度约25 μg·mL-1)加入(红)和不加入(黑) 10 µmol·L-1二氯苯基二甲脲(DCMU)和1 mmol·L-1羟胺(HA), 测量前莱茵衣藻暗适应20分钟; (C) 预照光对P515快速动力学的影响, 莱茵衣藻野生型在暗适应20分钟(黑)以及在光下持续照光2分钟(光强40 μmol·m-2·s-1), 黑暗1分钟(红)后的P515快速动力学。

该测量过程易受预照光的影响, 应确保样品在测量前处于完全黑暗状态。预照光会启动光合作用, 导致部分反应中心发生电荷分离, 驱动电子在光合膜上传递, 从而使饱和闪光诱导的快速上升幅度降低, 缓慢上升阶段消失(图1C) (Schreiber and Klughammer, 2008; Alric, 2014)。此外, 预照光会激活类囊体膜上的ATP合酶, 增加膜的H+传导性, 从而导致缓慢下降阶段显著加快, 因此通过缓慢下降阶段的衰减速率可判断类囊体膜的通透性(Schreiber and Klughammer, 2008)。

饱和闪光诱导的P515快速动力学曲线的原始信号以伏特为单位记录, 为将P515信号放大, 可通过校正程序将其转换成ΔI/I单位。以图1B为例, 在莱茵衣藻野生型中加入DCMU和HA后, 快速上升阶段的幅度为1.13×103 ΔI/I, 代表饱和闪光仅诱导PSI反应中心发生1次电荷分离, 产生1个电子, 即1 electron/PSI。为方便比较, P515快速动力学曲线数据除以PSI进行1次电荷分离的幅度, 可将纵坐标校准为每个PSI传递的电子数, 即electrons/PSI。

本文的其它图/表

• 图2 测量拟南芥叶绿体ATP合酶的质子传导性
  拟南芥离体叶片在光强为500 μmol·m^-2·s^-1的活化光(635 nm)下照光10分钟, 照光期间提供稳定的CO₂ (380 μmol·mol^-1)、湿度(60%大气湿度)和温度(23°C)。检测黑暗250 ms的P515衰减动力学, 重复100次后取平均值。ATP合酶的质子传导率为P515衰减动力学曲线半衰期(t_1/2)的倒数, 即94.3·s^-1。箭头表示活化光关闭。
  
• 图3 测量莱茵衣藻围绕PSI的环式电子传递速率
  莱茵衣藻野生型(WT)和PGR5突变体(Mutant)在光强为80 μmol·m^-2·s^-1的活化光(635 nm)下照光5分钟, 关光后检测围绕PSI的环式电子传递速率, 黑暗持续时间为250 ms。测量前, 藻细胞(浓度约25 μg·mL^-1)加入10 µmol·L^-1二氯苯基二甲脲(DCMU)、1 mmol·L^-1羟胺(HA)和20%的聚蔗糖, 暗适应20分钟。箭头表示活化光关闭。
  
• 图4 拟南芥质子动力势(pmf)及其组分(ΔΨ和ΔpH)的测定
  拟南芥离体叶片在光强为100 μmol·m^-2·s^-1 (WT 100, 黑)和750 μmol·m^-2·s^-1 (WT 750, 红)的活化光(635 nm)下照光3分钟, 照光期间提供稳定的CO₂ (380 μmol·mol^-1)、湿度(60%大气湿度)和温度(23°C)。黑暗时间60秒, 曲线为3次重复的平均值。测量前, 拟南芥叶片暗适应至少3小时。向上箭头表示活化光打开, 向下箭头表示活化光关闭。
  
• 图5 同步测量莱茵衣藻P515信号和叶绿素荧光
  将莱茵衣藻野生型(浓度约30 μg·mL^-1)暗适应20分钟, 放入荧光仪的测量室, 分别打开P515/535模块和叶绿素荧光模块的测量光, 测定初始荧光产量(F_o)。打开饱和闪光(635 nm, 6000 μmol·m^-2·s^-1, 持续时间250 ms), 测定黑暗状态下的最大荧光产量(F_m)。之后打开活化光(635 nm, 1500 μmol·m^-2·s^-1), 持续照光140秒, 期间每隔60秒施加1次饱和闪光, 测定光下最大荧光产量(F_m′)。活化光关闭后测定质子动力势(pmf)及其组分(ΔΨ和ΔpH), 与此同时每隔60秒施加1次饱和闪光, 检测黑暗状态下的荧光产量是否恢复到最大荧光产量(F_m)。F_o: 初始荧光产量; F_m: 最大荧光产量; F_m′: 光下最大荧光产量; F_s: 稳态荧光产量; Actinic light: 活化光; Saturating pulse: 饱和闪光; pmf: 质子动力势; ΔΨ: 跨膜电势; ΔpH: 跨膜质子梯度