P515的测量原理、方法和应用 植物学报    2021, 56 (5): 594-604.   DOI: 10.11983/CBB21052

图5 同步测量莱茵衣藻P515信号和叶绿素荧光
将莱茵衣藻野生型(浓度约30 μg·mL^-1)暗适应20分钟, 放入荧光仪的测量室, 分别打开P515/535模块和叶绿素荧光模块的测量光, 测定初始荧光产量(F_o)。打开饱和闪光(635 nm, 6000 μmol·m^-2·s^-1, 持续时间250 ms), 测定黑暗状态下的最大荧光产量(F_m)。之后打开活化光(635 nm, 1500 μmol·m^-2·s^-1), 持续照光140秒, 期间每隔60秒施加1次饱和闪光, 测定光下最大荧光产量(F_m′)。活化光关闭后测定质子动力势(pmf)及其组分(ΔΨ和ΔpH), 与此同时每隔60秒施加1次饱和闪光, 检测黑暗状态下的荧光产量是否恢复到最大荧光产量(F_m)。F_o: 初始荧光产量; F_m: 最大荧光产量; F_m′: 光下最大荧光产量; F_s: 稳态荧光产量; Actinic light: 活化光; Saturating pulse: 饱和闪光; pmf: 质子动力势; ΔΨ: 跨膜电势; ΔpH: 跨膜质子梯度

正文中引用本图/表的段落

植物体内存在多种能量耗散机制, 如叶绿素荧光淬灭和热耗散。这些能量耗散机制可能均受类囊体腔酸化的调控(付振书等, 2004), 同步检测活体样品在正常/高光胁迫条件下的P515信号与叶绿素荧光, 可得到实时准确的同步变化数据, 有利于分析各能量耗散机制之间的关系, 深入研究光保护机理。莱茵衣藻是研究光合作用的模式生物, 用强活化光(1 500 μmol·m-2·s-1)处理莱茵衣藻时, 会导致大部分光合反应中心关闭, 光化学量子产量降低, 对光合膜有害的过剩激发能量累积。此外, 光合电子传递将质子从类囊体基质不断转移到类囊体囊腔, 从而使类囊体囊腔不断酸化, 逐渐建立pmf, 与此同时激活非光化学猝灭(NPQ) (Demmig-Adams et al., 2012)。在莱茵衣藻中, NPQ依赖于一种色素结合蛋白-光捕获蛋白(LHCSR), 该蛋白具有pH敏感性。LHCSR的C端结构域暴露在类囊体囊腔侧, 随着类囊体囊腔的不断酸化, NPQ被激活, 从而耗散过剩的激发能, 启动光保护机制(Liguori et al., 2013)。随着强活化光的持续照光, 类囊体囊腔内外离子浓度逐渐平衡, pmf达到最大值。活化光关闭后, 类囊体腔内积累的质子通过ATP合酶快速释放到基质, 囊腔酸化程度降低, NPQ逐渐衰减至最低水平, 表现为P515信号先迅速下降至最低点, 然后不断恢复至暗基线, 而叶绿素荧光产量F_m′不断恢复至最大荧光产量(F_m) (图5)。由于P515信号比较灵敏, 受外界环境影响较大, 测量时可能会出现错误的信号, 分析数据时需要更加仔细。

本文的其它图/表

• 图1 饱和闪光诱导的P515快速动力学
  (A) 饱和闪光诱导的P515快速动力学示意图, 包括快速上升阶段(橙)、缓慢上升阶段(蓝)和缓慢下降阶段(绿), 箭头表示1次单周转饱和闪光(ST); (B) 饱和闪光诱导莱茵衣藻在520-550 nm的快速吸收变化(单周转饱和闪光波长635 nm, 光强200000 μmol·m^-2·s^-1, 持续时间5 μs), 莱茵衣藻野生型(WT) (浓度约25 μg·mL^-1)加入(红)和不加入(黑) 10 µmol·L^-1二氯苯基二甲脲(DCMU)和1 mmol·L^-1羟胺(HA), 测量前莱茵衣藻暗适应20分钟; (C) 预照光对P515快速动力学的影响, 莱茵衣藻野生型在暗适应20分钟(黑)以及在光下持续照光2分钟(光强40 μmol·m^-2·s^-1), 黑暗1分钟(红)后的P515快速动力学。
  
• 图2 测量拟南芥叶绿体ATP合酶的质子传导性
  拟南芥离体叶片在光强为500 μmol·m^-2·s^-1的活化光(635 nm)下照光10分钟, 照光期间提供稳定的CO₂ (380 μmol·mol^-1)、湿度(60%大气湿度)和温度(23°C)。检测黑暗250 ms的P515衰减动力学, 重复100次后取平均值。ATP合酶的质子传导率为P515衰减动力学曲线半衰期(t_1/2)的倒数, 即94.3·s^-1。箭头表示活化光关闭。
  
• 图3 测量莱茵衣藻围绕PSI的环式电子传递速率
  莱茵衣藻野生型(WT)和PGR5突变体(Mutant)在光强为80 μmol·m^-2·s^-1的活化光(635 nm)下照光5分钟, 关光后检测围绕PSI的环式电子传递速率, 黑暗持续时间为250 ms。测量前, 藻细胞(浓度约25 μg·mL^-1)加入10 µmol·L^-1二氯苯基二甲脲(DCMU)、1 mmol·L^-1羟胺(HA)和20%的聚蔗糖, 暗适应20分钟。箭头表示活化光关闭。
  
• 图4 拟南芥质子动力势(pmf)及其组分(ΔΨ和ΔpH)的测定
  拟南芥离体叶片在光强为100 μmol·m^-2·s^-1 (WT 100, 黑)和750 μmol·m^-2·s^-1 (WT 750, 红)的活化光(635 nm)下照光3分钟, 照光期间提供稳定的CO₂ (380 μmol·mol^-1)、湿度(60%大气湿度)和温度(23°C)。黑暗时间60秒, 曲线为3次重复的平均值。测量前, 拟南芥叶片暗适应至少3小时。向上箭头表示活化光打开, 向下箭头表示活化光关闭。