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谷子茎尖体外遗传转化体系的建立与优化
植物学报
2021, 56 (1):
71-79.
DOI: 10.11983/CBB20119
以谷子(Seteria italica)豫谷一号为实验材料, 建立了一套简便、稳定的体外茎尖遗传转化体系。通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的茎尖转化法, 对转化受体采取不同的处理方式, 待拟转化株长到三叶期后进行PCR鉴定。探明了草丁膦(Basta)喷施处理用于谷子转基因幼苗筛选的最适浓度, 以及2种不同检测方式(直接PCR和喷施Basta+PCR)鉴定转基因植株的效果。在上述基础上, 对影响谷子遗传转化体系的多种因素进行优化。结果表明, 菌液浓度(OD600)=1.4、侵染液中乙酰丁香酮浓度为800 μmol∙L -1、侵染压强为0.05 MPa、侵染40分钟有利于谷子茎尖的遗传转化。同时, 采用上述优化系统获得谷子转SiCBL4基因植株, 通过喷施草丁膦和实时荧光定量PCR对T2代转基因植株进行遗传稳定性分析, 可节约检测时间。综上, 该研究初步建立了稳定的谷子体外茎尖遗传转化体系, 并开发了一种便捷的检测后代转基因植株的组合方法。  View image in article
图6
农杆菌浓度(A)、乙酰丁香酮浓度(B)、侵染压强(C)、侵染时间(D)及同时改变4个变量(E)对谷子茎尖转化率的影响
数据为平均值±标准差(n=3)。Student’s t-test, * P<0.05。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
正文中引用本图/表的段落
为了研究菌液浓度对谷子遗传转化率的影响, 我们控制其它变量, 对菌液浓度设置了梯度。结果(图6A)表明, 随着农杆菌浓度的升高, 遗传转化率呈现先升后降的趋势, 当菌液OD600=1.4时, 转化率达到最大。农杆菌浓度较低时, 由于菌落数量较少, 导致转化效率较低, 而农杆菌浓度过高, 会因营养供应不足导致菌落活性有所下降, 且3次重复结果无显著差异。因此, 我们确定谷子遗传转化的最适农杆菌浓度为OD600= 1.4。
为了研究乙酰丁香酮浓度对谷子遗传转化率的影响, 我们控制其它变量, 对乙酰丁香酮浓度设置了梯度。结果(图6B)表明, 乙酰丁香酮的添加对谷子遗传转化效果的影响非常显著。在不添加乙酰丁香酮的情况下, 转化率为0; 在乙酰丁香酮浓度较低时, 随着浓度的增加, 转化率不断提高; 当乙酰丁香酮浓度为800 μmol?L-1时, 转化率达到最高(5%), 之后乙酰丁香酮的浓度继续增加, 转化率反而出现下降趋势, 且3次重复结果无显著差异。因此, 我们确定添加乙酰丁香酮的最佳浓度为800 μmol?L-1。
为了研究真空压强对谷子遗传转化率的影响, 我们控制其它变量, 对真空压强设置了不同梯度。结果(图6C)表明, 当压强处于0?0.04 MPa时, 随着压强的升高, 转化率逐渐提高, 当压强达到0.04 MPa时, 转化率暂时达到稳定。在压强为0.04、0.05和0.06 MPa 时转化率较高, 分别为1.7%、1.8%和1.6%, 三者相差较小; 之后压强继续升高, 转化率下降幅度更大,且3次重复结果无显著差异。因此, 综合考虑, 最佳压强确定为0.05 MPa。
为了研究侵染时间对谷子遗传转化率的影响, 我们控制其它变量, 对侵染时间设置了不同梯度。结果(图6D)表明, 转化率随着侵染时间的延长呈现先上升后下降趋势, 当侵染时间为40分钟时, 转化率最高(4%), 且3次重复结果无显著差异。因此, 侵染时间确定为40分钟。
由上述单因素试验确定了影响谷子遗传转化效率4个因素的最佳条件, 为得到最优的遗传转化体系, 与之前初步建立的体系条件进行了对比(表1)。利用优化前的条件进行侵染转化率约为1.5%, 而采用单因素试验优化后的条件转化率约6.2% (图6E)。因此, 优化菌液浓度、乙酰丁香酮浓度、真空压强及处理时间4个因素后, 遗传转化率得到明显提升。
本文的其它图/表
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