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谷子茎尖体外遗传转化体系的建立与优化

杨澜, 刘雅, 项阳, 孙秀娟, 颜景畏, 张阿英

植物学报 2021, 56 (1): 71-79. DOI: 10.11983/CBB20119

摘要（1471）

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以谷子(Seteria italica)豫谷一号为实验材料, 建立了一套简便、稳定的体外茎尖遗传转化体系。通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的茎尖转化法, 对转化受体采取不同的处理方式, 待拟转化株长到三叶期后进行PCR鉴定。探明了草丁膦(Basta)喷施处理用于谷子转基因幼苗筛选的最适浓度, 以及2种不同检测方式(直接PCR和喷施Basta+PCR)鉴定转基因植株的效果。在上述基础上, 对影响谷子遗传转化体系的多种因素进行优化。结果表明, 菌液浓度(OD₆₀₀)=1.4、侵染液中乙酰丁香酮浓度为800 μmol∙L ^-1、侵染压强为0.05 MPa、侵染40分钟有利于谷子茎尖的遗传转化。同时, 采用上述优化系统获得谷子转SiCBL4基因植株, 通过喷施草丁膦和实时荧光定量PCR对T₂代转基因植株进行遗传稳定性分析, 可节约检测时间。综上, 该研究初步建立了稳定的谷子体外茎尖遗传转化体系, 并开发了一种便捷的检测后代转基因植株的组合方法。

	Agrobacterium concentration (OD₆₀₀)	Acetosyringone concentration (μmol?L^-1)	Pressure (MPa)	Time (min)
Before optimization	1.0	400	0.04	20
After optimization	1.4	800	0.05	40

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表1 初步建立的体系和优化后的体系条件对比

正文中引用本图/表的段落

参考贺美林(2018)的方法并进行修改。选取健康饱满的谷子种子于水中浸泡, 置于4°C冰箱春化2-3天后, 将种子均匀撒在铺有湿润滤纸的培养皿中, 置于30°C培养箱暗培养约3天, 期间不定期喷水以保证滤纸湿润。待谷子黄化苗茎长到约1 cm, 采取3种不同的方式对转化受体进行处理: (1) 利用刀片在谷子茎尖生长点处呈45°斜切一刀, 去掉胚芽鞘尖端(称之为一刀法); (2) 在谷子茎尖生长点处横竖各切一刀(称之为两刀法); (3) 不需要做切除处理, 直接将整株幼苗进行侵染(称之为未切法)。随后将不同处理方式的谷子置于含400 μmol?L-1乙酰丁香酮的侵染液中, 在0.04 MPa真空压力下侵染20分钟。侵染完成后直接将谷子铺在装有营养基质(营养土:蛭石=1:1, v/v)的盆中, 并在谷子表面铺撒少量的营养基质(营养土:蛭石=1:2, v/v), 以避免根部缺水死亡。置于28°C暗培养1天后取出, 在28°C温室中继续正常培养。

由上述单因素试验确定了影响谷子遗传转化效率4个因素的最佳条件, 为得到最优的遗传转化体系, 与之前初步建立的体系条件进行了对比(表1)。利用优化前的条件进行侵染转化率约为1.5%, 而采用单因素试验优化后的条件转化率约6.2% (图6E)。因此, 优化菌液浓度、乙酰丁香酮浓度、真空压强及处理时间4个因素后, 遗传转化率得到明显提升。

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