谷子茎尖体外遗传转化体系的建立与优化 植物学报    2021, 56 (1): 71-79.   DOI: 10.11983/CBB20119

图3 谷子茎尖遗传转化体系的建立
(A) 待萌发的种子; (B) 萌发3天后的种子; (C) 转化5天后的幼苗; (D) 拔节期植株; (E) 抽穗期植株; (F) 成熟种子。(A), (C), (E) Bars=1.0 cm; (B) Bar=0.5 cm; (D) Bar=10.0 cm; (F) Bar=5.0 cm

正文中引用本图/表的段落

为初步建立农杆菌介导的谷子茎尖遗传转化体系, 分别采取一刀法、两刀法和未切法3种方式处理转化受体, 每种方式各获得至少400株幼苗。侵染3天后, 对其中200株幼苗进行GUS染色。结果(图2A)表明, 采取一刀法和两刀法获得的谷子没有染出蓝色, 而直接利用未切法可以染出蓝色(2.5%, 5株/200株)。随后提取另外200株谷子幼苗(三叶期)的新叶DNA并进行Bar基因检测, 结果(图2B)发现, 采取一刀法和两刀法获得的谷子没有鉴定出Bar基因, 而直接利用未切法虽然转化率较低, 却可以检测到Bar基因(3%, 6株/ 200株), 这与GUS染色结果基本一致。因此我们推测, 造成2种检测方法转化率略有差异的原因可能是: (1) GUS染色不如Bar基因检测灵敏; (2) 可能两组(各200株)本身的转化率就不完全一致。因此可以确定, 当以谷子茎尖为转化受体建立遗传转化体系时, 采取未切法较为合适。其体系为: 制备转化菌液置于30°C培养箱待用, 同时将谷子均匀铺在含有湿润滤纸的培养皿中(图3A), 然后置于30°C培养箱避光处理3天。待谷子茎长到约1 cm (图3B)时, 直接将谷子置于菌液浓度(OD₆₀₀)为1.0的侵染液中, 并加入400 μmol?L-1乙酰丁香酮, 在0.04 MPa真空压强下处理20分钟。侵染完成后直接将谷子铺在装有营养基质的盆中, 置于28°C暗培养1天后取出, 在28°C温室中继续培养(图3C)。待长到三叶期进行PCR鉴定, 筛选阳性转基因植株。然后将转基因植株移栽到较大的花盆中进行正常生长管理, 经历拔节期(图3D)和抽穗期(图3E)等过程, 3-4个月后得到成熟种子(图3F)。

本文的其它图/表

• 图1 pCUN-NHF质粒T-DNA区段示意图
  LB: LB T-DNA重复; Ubi promoter: 玉米Ubiquitin1启动子; HA: HA标签; MCS: 多克隆位点; 35S promoter: CaMV35S启动子; Bar: 抗草铵膦基因; RB: RB T-DNA重复
  
• 图2 谷子转基因植株鉴定
  (A) 谷子幼苗GUS染色图(bar=0.1 cm); (B) PCR鉴定(1: 阳性对照; 2: 阴性对照; 3: 切一刀的植株叶片; 4: 切两刀的植株叶片; 5: 不做切除处理的植株叶片)
  
• 图4 不同浓度的草丁膦对谷子幼苗存活率的影响
  (A) 不同浓度的草丁膦处理谷子的表型图(bar=5.0 cm); (B) 不同浓度草丁膦处理下谷子的存活率。数据为平均值±标准差(n=3)。Student’s t-test, ** P<0.01, *** P<0.001
  
• 图5 两种不同方式检测转基因植株的转化率
  数据为平均值±标准差(n=3)。Student’s t-test, * P<0.05
  
• 图6 农杆菌浓度(A)、乙酰丁香酮浓度(B)、侵染压强(C)、侵染时间(D)及同时改变4个变量(E)对谷子茎尖转化率的影响
  数据为平均值±标准差(n=3)。Student’s t-test, * P<0.05。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
  
• 表1 初步建立的体系和优化后的体系条件对比
  
• 图7 qRT-PCR分析谷子转基因植株中SiCBL4基因表达量
  数据为平均值±标准差(n=3)。Student’s t-test, * P<0.05, ** P<0.01