植物学报 ›› 2017, Vol. 52 ›› Issue (5): 568-578.DOI: 10.11983/CBB16225
马骊1, 孙万仓1,*(), 袁金海1, 刘自刚1, 武军艳1, 方彦1, 许耀照2, 蒲媛媛1, 白静1, 董小云1, 何辉立1
收稿日期:
2016-11-23
接受日期:
2017-03-24
出版日期:
2017-09-01
发布日期:
2017-07-10
通讯作者:
孙万仓
基金资助:
Li Ma1, Wancang Sun1,*(), Jinhai Yuan1, Zigang Liu1, Junyan Wu1, Yan Fang1, Yaozhao Xu2, Yuanyuan Pu1, Jing Bai1, Xiaoyun Dong1, Huili He1
Received:
2016-11-23
Accepted:
2017-03-24
Online:
2017-09-01
Published:
2017-07-10
Contact:
Wancang Sun
摘要: 为探明β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase)对油菜(Brassica campestris)抵御低温胁迫能力的作用, 通过蛋白质谱分析得到β-1,3-葡聚糖酶蛋白, 采用RT-PCR技术克隆白菜型冬油菜(B. rapa)陇油6号和天油4号β-1,3-葡聚糖酶的cDNA序列; 并对该序列进行生物信息学分析; 进而采用实时荧光定量PCR及半定量PCR检测β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达模式。结果获得长度为1 032 bp的陇油6号β-1,3-葡聚糖酶基因开放阅读框, 编码343个氨基酸, 相对分子量为38.102 kDa, 理论等电点为6.63, 其与菜心(B. rapa subsp. chinensis)和甘蓝型油菜(B. napus)的蛋白质氨基酸序列同源性高达93.94%。该基因编码的酶是一个主要由α-螺旋组成的亲水性稳定蛋白, 含有1个信号肽, 存在2个跨膜结构域。该基因在进化上高度保守, 其保守序列属于植物的糖基水解酶家族17特有的保守结构域。β-1,3-葡聚糖酶基因表达模式分析显示, 4°C时该基因上调表达, 继续低温(-4°C)胁迫处理, 该基因上调表达至峰值, 至-8°C时其表达下调。研究表明从白菜型冬油菜中克隆的β-1,3-glucanase在冬油菜品种陇油6号抗寒过程中发挥作用。
马骊, 孙万仓, 袁金海, 刘自刚, 武军艳, 方彦, 许耀照, 蒲媛媛, 白静, 董小云, 何辉立. 白菜型冬油菜β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达. 植物学报, 2017, 52(5): 568-578.
Li Ma, Wancang Sun, Jinhai Yuan, Zigang Liu, Junyan Wu, Yan Fang, Yaozhao Xu, Yuanyuan Pu, Jing Bai, Xiaoyun Dong, Huili He. Expression Analysis of β-1,3-Glucanase Gene from Winter Brassica rapa Under Low Temperature Stress. Chinese Bulletin of Botany, 2017, 52(5): 568-578.
图1 白菜型冬油菜陇油6号叶片质外体蛋白图谱M: 标准蛋白; 1: 类枯草菌素蛋白酶; 2: 叶绿体热休克蛋白70-1; 3: 黑芥子酶; 4: S-腺苷-L-同半胱氨酸水解酶; 5: 基本葡聚糖酶; 6: β-1,3-葡聚糖酶; 7: 病程相关蛋白1
Figure 1 Apoplast protein map of Brassica rapa cv. ‘Long- you6’ leavesM: Protein marker; 1: Subtilisin-like protease; 2: Chloroplast heat shock protein 70-1; 3: Myrosinase; 4: S-adenosyl-L- homocystein hydrolase; 5: Basic glucanase; 6: β-1,3-gluca- nase; 7: Pathogenesis- related protein-1
Spot No. | NCBI accession No. | Protein name | Organism | Score | Sequence coverage (%) |
---|---|---|---|---|---|
1 | gi|757534 | Subtilisin-like protease | Arabidopsis thaliana | 146 | 3 |
2 | gi|166919370 | Chloroplast heat shock protein 70-1 | Ipomoea nil | 291 | 6 |
3 | gi|11034734 | Myrosinase | Raphanus sativus | 98 | 6 |
4 | gi|32967699 | S-adenosyl-L-homocystein hydrolase | A. thaliana | 290 | 29 |
5 | gi|118763538 | Basic glucanase | Brassica juncea | 315 | 53 |
6 | gi|62361691 | β-1,3-glucanase | B. rapa subsp. | 348 | 48 |
7 | gi|722274 | Pathogenesis-related protein-1 | B. juncea | 78 | 41 |
表1 白菜型冬油菜陇油6号叶片质外体蛋白质谱鉴定
Table 1 Mass spectrometry results of apoplast proteins in Brassica rapa cv. ‘Longyou6’ leaves
Spot No. | NCBI accession No. | Protein name | Organism | Score | Sequence coverage (%) |
---|---|---|---|---|---|
1 | gi|757534 | Subtilisin-like protease | Arabidopsis thaliana | 146 | 3 |
2 | gi|166919370 | Chloroplast heat shock protein 70-1 | Ipomoea nil | 291 | 6 |
3 | gi|11034734 | Myrosinase | Raphanus sativus | 98 | 6 |
4 | gi|32967699 | S-adenosyl-L-homocystein hydrolase | A. thaliana | 290 | 29 |
5 | gi|118763538 | Basic glucanase | Brassica juncea | 315 | 53 |
6 | gi|62361691 | β-1,3-glucanase | B. rapa subsp. | 348 | 48 |
7 | gi|722274 | Pathogenesis-related protein-1 | B. juncea | 78 | 41 |
图3 β-1,3-glucanase基因编码区核酸序列及编码氨基酸序列上游的起始密码子ATG用方框表示; * 为终止密码子TAA的位置。
Figure 3 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of β-1,3-glucanase cDNAAn upstream in-flame start codon ATG is boxed; * indicates the positions of termination codon TAA.
图4 白菜型冬油菜陇油6号β-1,3-葡聚糖酶蛋白生物信息学分析(A) 用ProtScale程序预测蛋白质疏水性; (B) 用Signal P4程序预测信号肽; (C) 用TMpred程序预测β-1,3-葡聚糖酶的跨膜区段; (D) 结构域预测; (E) 二级结构预测; (F) 三级结构预测
Figure 4 Bioinformatic analysis of β-1,3-glucanase protein in Brassica rapa cv. ‘Longyou6’(A) Predicted protein hydrophobicity by ProtScale; (B) Predicted signal peptide by Signal P4; (C) Transmembrane helical segments predicted by TMpred; (D) Predication of domains; (E) Predicted secondary structure; (F) Predicted 3-D structure
Cruciferous plants | No. of amino acids | Molecular weight (kDa) | Theoretical isoelectric point | Protein instability index | Grand average of hydropathicity | Composition of amino acid | The main amino acid (%) |
---|---|---|---|---|---|---|---|
Longyou6 | 343 | 38.102 | 6.63 | 39.58 | -0.334 | 20 | Asn (9.6), Leu (8.7) |
Tianyou4 | 343 | 38.130 | 7.68 | 39.02 | -0.337 | 20 | Asn (9.6), Leu (8.7) |
Brassica rapa | 342 | 38.180 | 7.69 | 42.99 | -0.370 | 20 | Asn (9.6), Leu (8.8) |
B. rapa subsp. chinensis | 363 | 40.659 | 9.27 | 39.84 | -0.335 | 20 | Asn (8.8), Leu (8.3) |
B. napus | 363 | 40.599 | 9.22 | 39.96 | -0.325 | 20 | Asn (9.1), Leu (8.3) |
B. oleracea | 351 | 38.925 | 6.85 | 40.48 | -0.304 | 20 | Asn (8.8), Ser (8.5) |
B. oleracea var. oleracea | 365 | 41.075 | 9.27 | 37.84 | -0.390 | 20 | Asn (8.8), Leu (7.7) |
B. juncea | 346 | 38.087 | 9.13 | 38.03 | -0.188 | 20 | Gly (9.5), Leu (9.0) |
Raphanus sativus | 345 | 38.243 | 6.20 | 40.33 | -0.326 | 20 | Leu (10.1), Asn (8.4) |
Arabidopsis thaliana | 355 | 39.380 | 5.47 | 47.15 | -0.318 | 20 | Ser (9.3), Leu (8.7) |
表2 十字花科植物β-1,3-glucanase基因编码蛋白的理化性质预测
Table 2 Predicted physicochemical properties of β-1,3-glucanase gene encoding proteins in cruciferae plants
Cruciferous plants | No. of amino acids | Molecular weight (kDa) | Theoretical isoelectric point | Protein instability index | Grand average of hydropathicity | Composition of amino acid | The main amino acid (%) |
---|---|---|---|---|---|---|---|
Longyou6 | 343 | 38.102 | 6.63 | 39.58 | -0.334 | 20 | Asn (9.6), Leu (8.7) |
Tianyou4 | 343 | 38.130 | 7.68 | 39.02 | -0.337 | 20 | Asn (9.6), Leu (8.7) |
Brassica rapa | 342 | 38.180 | 7.69 | 42.99 | -0.370 | 20 | Asn (9.6), Leu (8.8) |
B. rapa subsp. chinensis | 363 | 40.659 | 9.27 | 39.84 | -0.335 | 20 | Asn (8.8), Leu (8.3) |
B. napus | 363 | 40.599 | 9.22 | 39.96 | -0.325 | 20 | Asn (9.1), Leu (8.3) |
B. oleracea | 351 | 38.925 | 6.85 | 40.48 | -0.304 | 20 | Asn (8.8), Ser (8.5) |
B. oleracea var. oleracea | 365 | 41.075 | 9.27 | 37.84 | -0.390 | 20 | Asn (8.8), Leu (7.7) |
B. juncea | 346 | 38.087 | 9.13 | 38.03 | -0.188 | 20 | Gly (9.5), Leu (9.0) |
Raphanus sativus | 345 | 38.243 | 6.20 | 40.33 | -0.326 | 20 | Leu (10.1), Asn (8.4) |
Arabidopsis thaliana | 355 | 39.380 | 5.47 | 47.15 | -0.318 | 20 | Ser (9.3), Leu (8.7) |
图7 低温胁迫下白菜型冬油菜β-1,3-glucanase基因的半定量RT-PCR分析(A) 陇油6号; (B) 天油4号
Figure 7 Semi-quantitative RT-PCR analysis of β-1,3-glucanase gene in winter Brassica rapa under low temperature stress(A) Longyou6; (B) Tianyou4
图8 低温胁迫下白菜型冬油菜叶片β-1,3-glucanase基因的相对表达量
Figure 8 The relative expression level of β-1,3-glucanase gene in leaves of winter Brassica rapa under low temperature stress
[1] |
陈芳兰, 林玉玲, 陈裕坤, 冯新, 张梓浩, 赖钟雄 (2015). 三明野生蕉β-1,3-葡聚糖酶基因克隆及其低温下SA处理后的表达分析. 西北植物学报 35, 1709-1721.
DOI URL |
[2] |
程红梅, 简桂良, 倪万潮, 杨红华, 王志兴, 孙文姬, 张保龙, 王晓峰, 马存, 贾士荣 (2005). 转几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因提高棉花对枯萎病和黄萎病的抗性. 中国农业科学 38, 1160-1166.
DOI URL |
[3] |
邓文星, 张映 (2007). 实时荧光定量PCR技术综述. 生物技术通报(5), 93-95, 103.
DOI URL |
[4] | 高玉龙, 郭旺珍, 王磊, 张天真 (2007). 一个棉花β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA的克隆与特征分析. 作物学报 33, 1310-1315. |
[5] | 龚束芳, 杨涛, 车代弟 (2010). 抗冻蛋白溶液中冰晶生长行为的研究. 上海交通大学学报(农业科学版) 28, 265-268, 279. |
[6] | 郭尧君 (2005). 蛋白质电泳实验技术(第2版). 北京: 科学出版社. pp. 123-156. |
[7] | 何江峰, 韩冰, 郭慧琴, 张占雄, 赵雅丽 (2007). 燕麦β-1,3-葡聚糖酶II基因3′端cDNA的克隆及分析. 生物技术 17(1), 5-8. |
[8] | 何江峰, 韩冰, 赵宏鑫 (2006). 植物β-1,3-葡聚糖酶的研究进展. 内蒙古农业科技 5, 21-25. |
[9] |
蒋选利, 李振岐, 康振生 (2005). β-1,3-葡聚糖酶与植物的抗病性. 西北农业学报 14, 135-139.
DOI URL |
[10] |
蓝海燕, 王长海, 张丽华, 刘桂珍, 王岚兰, 陈正华, 田颖川 (2000). 导入β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶基因的转基因可育油菜及其抗菌核病的研究. 生物工程学报 16, 142-146.
DOI URL |
[11] |
林植芳, 刘楠 (2012). 活性氧调控植物生长发育的研究进展. 植物学报 47, 74-86.
DOI URL |
[12] |
马文月 (2004). 植物冷害和抗冷性的研究进展. 安徽农业科学 32, 1003-1006.
DOI URL |
[13] |
欧阳波, 李汉霞, 叶志彪 (2002). 植物β-1,3-葡聚糖酶及其基因. 中国生物工程杂志 22, 18-23.
DOI URL |
[14] |
孙万仓, 马卫国, 雷建民, 刘秦, 杨仁义, 武军艳, 王学芳, 叶剑, 曾军, 张亚宏, 康艳丽, 郭秀娟, 魏文惠, 杨杰, 蒲媛媛, 曾潮武, 刘红霞 (2007). 冬油菜在西北旱寒区的适应性和北移的可行性研究. 中国农业科学 40, 2716-2726.
DOI URL |
[15] | 孙万仓, 刘自刚, 周冬梅, 张仁陟 (2016). 北方冬油菜北移与区划. 北京: 科学出版社. pp. 45-47. |
[16] |
杨刚, 史鹏辉, 孙万仓, 刘自刚, 曾秀存, 武军艳, 方彦, 李学才, 陈奇, 刘林波, 杨建胜, 方园, 张娟 (2016). 白菜型冬油菜质外体抗冻蛋白研究. 中国生态农业学报 24, 210-217.
DOI URL |
[17] | 翟国会, 阮小蕾, 吴丽婷, 谭小勇, 李华平 (2011). 指天蕉β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA的克隆及序列分析. 中国农业科学 44, 3134-3141. |
[18] |
张妙霞 (2010). 野生香蕉(Musa spp., AB group)抗寒相关基因的克隆与表达分析. 博士论文. 福州: 福建农林大学. pp. 134-140.
DOI URL |
[19] | 赵娟, 兰海燕 (2011). 拟南芥β-1,3-葡聚糖酶基因(BG1)在不同组织及非生物胁迫下的表达研究. 新疆农业科学 48, 712-718. |
[20] |
周丽英, 杨丽涛, 郑坚瑜 (2001). 植物抗寒冻基因工程研究进展. 植物学通报 18, 325-331.
DOI URL |
[21] |
Beffa R, Meins Jr FM (1996). Pathogenesis-related function of plant β-1,3-glucanae investigated by antisense transformation—a review.Gene 179, 97-103.
DOI URL PMID |
[22] |
Bradford MM (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Analytical Biochem 72, 248-254.
DOI URL |
[23] |
Griffith M, Ala P, Yang DSC, Hon WC, Moffatt BA (1992). Antifreeze protein produced endogenously in winter rye leaves.Plant Physiol 100, 593-596.
DOI URL |
[24] |
Hon WC, Griffith M, Chong P, Yang DSC (1994). Extraction and isolation of antifreeze proteins from winter rye (Secale cereale L.) leaves.Plant Physiol 104, 971-980.
DOI URL PMID |
[25] |
Masoud SA, Zhu Q, Lamb C, Dixon RA (1996). Constitutive expression of an inducible β-1,3-glucanase in alfalfa reduces disease severity caused by the oomycete patho- gen Phytophthora megasperma f. spmedicaginis, but does not reduce disease severity of chitin-containing fungi.Transgenic Res 5, 313-323.
DOI URL |
[26] |
Mezabasso L, Alberdi M, Raynal M, Ferrerocadinanos ML, Delseny M (1986). Changes in protein synthesis in rapeseed (Brassica napus) seedlings during a low temperature treatment.Plant Physiol 82, 733-738.
DOI URL PMID |
[27] |
Nakamura Y, Sawada H, Kobayashi S, Nakajima I, Yoshikawa M (1999). Expression of soybean β-1,3-endo- glucanase cDNA and effect on disease tolerance in kiwifruit plants.Plant Cell Rep 18, 527-532.
DOI URL |
[28] |
Xiong LM, Zhu JK (2001). Abiotic stress signal transduction in plants: molecular and genetic perspectives.Physiol Plant 112, 152-166.
DOI URL PMID |
[29] |
Zhu Q, Maher EA, Masoud S, Dixon RA, Lamb CJ (1994). Enhanced protection against fungal attack by constitutive co-expression of chitinase and glucanase genes in trans- genic tobacco.Biol Technol 12, 807-812.
DOI URL |
[1] | 高敏, 缑倩倩, 王国华, 郭文婷, 张宇, 张妍. 低温胁迫对不同母树年龄柠条锦鸡儿种子萌发幼苗生理和生长的影响[J]. 植物生态学报, 2024, 48(2): 201-214. |
[2] | 段政勇, 丁敏, 王宇卓, 丁艺冰, 陈凌, 王瑞云, 乔治军. 糜子SBP基因家族全基因组鉴定及表达分析[J]. 植物学报, 2024, 59(2): 231-244. |
[3] | 师生波, 周党卫, 李天才, 德科加, 杲秀珍, 马家麟, 孙涛, 王方琳. 青藏高原高山嵩草光合功能对模拟夜间低温的响应[J]. 植物生态学报, 2023, 47(3): 361-373. |
[4] | 孙福辉, 方慧仪, 温小蕙, 张亮生. 马银花MADS-box基因家族系统进化与表达分析[J]. 植物学报, 2023, 58(3): 404-416. |
[5] | 师生波, 师瑞, 周党卫, 张雯. 低温对高山嵩草叶片光化学和非光化学能量耗散特征的影响[J]. 植物生态学报, 2023, 47(10): 1441-1452. |
[6] | 陈奕竹, 郎伟光, 陈效逑. 中国北方树木秋季物候的过程模拟及其区域分异归因[J]. 植物生态学报, 2022, 46(7): 753-765. |
[7] | 于海英, 杨莉琳, 付素静, 张志敏, 姚琦馥. 暖温带森林木本植物展叶始期对低温和热量累积变化的响应[J]. 植物生态学报, 2022, 46(12): 1573-1584. |
[8] | 吴丹丹, 陈永坤, 杨宇, 孔春艳, 龚明. 小桐子半胱氨酸蛋白酶家族和相应miRNAs的鉴定及其对低温锻炼的响应[J]. 植物学报, 2021, 56(5): 544-558. |
[9] | 张雅文, 梁山, 徐国云, 郭无瑕, 邓书林. 烟草CONSTANS-like基因家族的鉴定与分析[J]. 植物学报, 2021, 56(1): 33-43. |
[10] | 杨小青,黄晓琴,韩晓阳,刘腾飞,岳晓伟,伊冉. 外源物质对茶树耐寒及蔗糖代谢关键基因表达的影响[J]. 植物学报, 2020, 55(1): 21-30. |
[11] | 刘栋峰,唐永严,雒胜韬,罗伟,李志涛,种康,徐云远. 利用低温水浴鉴定水稻苗期耐寒性[J]. 植物学报, 2019, 54(4): 509-514. |
[12] | 范业赓,丘立杭,黄杏,周慧文,甘崇琨,李杨瑞,杨荣仲,吴建明,陈荣发. 甘蔗节间伸长过程赤霉素生物合成关键基因的表达及相关植物激素动态变化[J]. 植物学报, 2019, 54(4): 486-496. |
[13] | 杨德卫,王莫,韩利波,唐定中,李生平. 水稻稻瘟病抗性基因的克隆、育种利用及稻瘟菌无毒基因研究进展[J]. 植物学报, 2019, 54(2): 265-276. |
[14] | 陈建权, 程晨, 张梦恬, 张向前, 张尧, 王爱英, 祝建波. 天山雪莲SiSAD基因与拟南芥AtFAB2基因转化 烟草的抗寒性分析[J]. 植物学报, 2018, 53(5): 603-611. |
[15] | 段志坤, 秦晓惠, 朱晓红, 宋纯鹏. 解析植物冷信号转导途径: 植物如何感知低温[J]. 植物学报, 2018, 53(2): 149-153. |
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