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一个新的黄瓜叶色突变体鉴定、初定位及转录组分析
植物学报
2025, 60 (4):
515-532.
DOI: 10.11983/CBB24112
叶色突变体是研究光形态发生、叶绿体发育、叶绿素代谢和光合作用机制等多种生理过程的理想材料。该研究从黄瓜(Cucumis sativus) XYYH-2-1-1株系自交后代中获得1个新的黄化致死突变体ycl (yellow cotyledon lethal)。该突变体自幼苗出土后子叶一直呈黄化状态, 约2周后枯萎死亡, 其生长抑制表型为非光依赖型。与野生型相比, ycl突变体的Chl a和Chl b含量趋于零, 叶绿素生物合成途径中Mg2+螯合过程受阻。显微和超微结构分析发现, ycl叶片组织紊乱、叶绿体发育受阻。ycl的抗氧化酶活性及丙二醛含量显著升高, 说明其受到氧化胁迫, 且抗氧化能力强。ycl净光合速率极显著降低, 胞间CO2浓度上升, 推测ycl光合速率降低源于气孔导度降低、叶绿素含量减少和叶绿体发育受阻。转录组学分析表明, ycl与其野生型间存在337个差异表达基因, 光合作用、类黄酮生物合成、叶绿素代谢和活性氧代谢是导致ycl黄化致死表型形成的关键途径。通过BSA-Seq分析, ycl突变基因初步定位于3号染色体的1.48-1.9 Mb区间, 内含41个候选基因。对ycl突变体的研究为阐明黄瓜叶绿体发育的分子机制提供了参考。  View image in article
图5
突变基因的初定位及筛选
(A)-(C) 单核苷酸多态性分布((A) 第18号群体; (B) XY子叶群体; (C) XY真叶群体); (D) CsaV3_3G001980相对表达量(**表示差异极显著, t检验, P<0.01); (E)-(G) SNP index峰图((E) 第18号群体; (F) XY子叶群体; (G) XY真叶群体)。WT: 野生型; SNP: 单核苷酸多态性
正文中引用本图/表的段落
分别对ycl和XYYH-3-1子叶期叶片进行显微观察, 发现野生型叶片中, 海绵组织与栅栏组织结构饱满、排列有序且紧密(图3A, B); 突变体ycl中, 栅栏组织和海绵组织细胞排列散乱, 缺乏明确的界限, 细胞之间的空隙较大, 叶脉也相对较小(图3C, D), 表明ycl的叶片组织发育异常。用透射电镜(transmission electron microscope, TEM)观察ycl突变体和野生型子叶的超微结构, 发现野生型叶片的叶绿体形状大多为长椭圆形或梭形, 细胞内数目多(图3E); ycl突变体叶片的叶绿体膨胀成近圆形(图3G)。与野生型相比, ycl突变体的叶绿体结构简单且发育不良, 基粒片层稀疏, 叶绿体内积累了大量的嗜锇体(图5H), 表明黄化致死突变体ycl的叶绿体发育存在明显缺陷。
分别对ycl和XYYH-3-1子叶期叶片进行显微观察, 发现野生型叶片中, 海绵组织与栅栏组织结构饱满、排列有序且紧密(图3A, B); 突变体ycl中, 栅栏组织和海绵组织细胞排列散乱, 缺乏明确的界限, 细胞之间的空隙较大, 叶脉也相对较小(图3C, D), 表明ycl的叶片组织发育异常。用透射电镜(transmission electron microscope, TEM)观察ycl突变体和野生型子叶的超微结构, 发现野生型叶片的叶绿体形状大多为长椭圆形或梭形, 细胞内数目多(图3E); ycl突变体叶片的叶绿体膨胀成近圆形(图3G)。与野生型相比, ycl突变体的叶绿体结构简单且发育不良, 基粒片层稀疏, 叶绿体内积累了大量的嗜锇体(图5H), 表明黄化致死突变体ycl的叶绿体发育存在明显缺陷。
BSA混池测序结果显示, 在第18号群体中获得15 323个差异SNP, 在XY子叶群体中获得18 953个差异SNP, 在XY真叶群体中获得20 973个差异SNP, 在3个群体中获得野生亲本纯合、隐性池差异且纯合、显性池纯合或杂合的位点分别有19、51和730个SNP, 以1 000 000 bp为窗口, 100 000 bp为步长, 根据隐性池减去显性池的SNP index作图(图5), 发现3号染色体上SNP密集, 且在3个群体中有重叠。由于与目标性状关联的SNP在染色体上连锁遗传, 故将目的基因初定位在第3号染色体的1.48-1.9 Mb区间, 此候选区段中包含41个蛋白编码基因(表5), 后续将进一步精细定位以获得候选突变位点。
BSA混池测序结果显示, 在第18号群体中获得15 323个差异SNP, 在XY子叶群体中获得18 953个差异SNP, 在XY真叶群体中获得20 973个差异SNP, 在3个群体中获得野生亲本纯合、隐性池差异且纯合、显性池纯合或杂合的位点分别有19、51和730个SNP, 以1 000 000 bp为窗口, 100 000 bp为步长, 根据隐性池减去显性池的SNP index作图(图5), 发现3号染色体上SNP密集, 且在3个群体中有重叠。由于与目标性状关联的SNP在染色体上连锁遗传, 故将目的基因初定位在第3号染色体的1.48-1.9 Mb区间, 此候选区段中包含41个蛋白编码基因(表5), 后续将进一步精细定位以获得候选突变位点。
取ycl及野生型子叶期(7天)植株根、茎和叶, 利用荧光定量PCR对候选区间内CsaV3_3G001980基因进行表达量分析, 发现在根和茎中, ycl基因的表达量极显著低于野生型; 在叶中, 其表达量极显著高于野生型(图5)。CsaV3_3G001980编码NPF (NITRATE TRANSPORTER 1/PEPTIDE TRANSPORTER FAMI- LY)蛋白, 与拟南芥NRT1.5编码基因同源, NRT1.5参与硝酸盐从根到茎的木质部运输, 推测ycl突变体中该基因的表达量下降会影响硝酸盐的运输, 导致叶色发生变化。候选基因CsaV3_3G001980序列全长为6 364 bp, 设计包含启动子区在内的CsaV3_3G001980 gDNA引物, 分段进行克隆测序, 对测序数据拼接并比对, 结果证实未发生基因突变。
取ycl及野生型子叶期(7天)植株根、茎和叶, 利用荧光定量PCR对候选区间内CsaV3_3G001980基因进行表达量分析, 发现在根和茎中, ycl基因的表达量极显著低于野生型; 在叶中, 其表达量极显著高于野生型(图5)。CsaV3_3G001980编码NPF (NITRATE TRANSPORTER 1/PEPTIDE TRANSPORTER FAMI- LY)蛋白, 与拟南芥NRT1.5编码基因同源, NRT1.5参与硝酸盐从根到茎的木质部运输, 推测ycl突变体中该基因的表达量下降会影响硝酸盐的运输, 导致叶色发生变化。候选基因CsaV3_3G001980序列全长为6 364 bp, 设计包含启动子区在内的CsaV3_3G001980 gDNA引物, 分段进行克隆测序, 对测序数据拼接并比对, 结果证实未发生基因突变。
分别对ycl和XYYH-3-1子叶期叶片进行显微观察, 发现野生型叶片中, 海绵组织与栅栏组织结构饱满、排列有序且紧密(图3A, B); 突变体ycl中, 栅栏组织和海绵组织细胞排列散乱, 缺乏明确的界限, 细胞之间的空隙较大, 叶脉也相对较小(图3C, D), 表明ycl的叶片组织发育异常。用透射电镜(transmission electron microscope, TEM)观察ycl突变体和野生型子叶的超微结构, 发现野生型叶片的叶绿体形状大多为长椭圆形或梭形, 细胞内数目多(图3E); ycl突变体叶片的叶绿体膨胀成近圆形(图3G)。与野生型相比, ycl突变体的叶绿体结构简单且发育不良, 基粒片层稀疏, 叶绿体内积累了大量的嗜锇体(图5H), 表明黄化致死突变体ycl的叶绿体发育存在明显缺陷。
BSA混池测序结果显示, 在第18号群体中获得15 323个差异SNP, 在XY子叶群体中获得18 953个差异SNP, 在XY真叶群体中获得20 973个差异SNP, 在3个群体中获得野生亲本纯合、隐性池差异且纯合、显性池纯合或杂合的位点分别有19、51和730个SNP, 以1 000 000 bp为窗口, 100 000 bp为步长, 根据隐性池减去显性池的SNP index作图(图5), 发现3号染色体上SNP密集, 且在3个群体中有重叠。由于与目标性状关联的SNP在染色体上连锁遗传, 故将目的基因初定位在第3号染色体的1.48-1.9 Mb区间, 此候选区段中包含41个蛋白编码基因(表5), 后续将进一步精细定位以获得候选突变位点。
分别对ycl和XYYH-3-1子叶期叶片进行显微观察, 发现野生型叶片中, 海绵组织与栅栏组织结构饱满、排列有序且紧密(图3A, B); 突变体ycl中, 栅栏组织和海绵组织细胞排列散乱, 缺乏明确的界限, 细胞之间的空隙较大, 叶脉也相对较小(图3C, D), 表明ycl的叶片组织发育异常。用透射电镜(transmission electron microscope, TEM)观察ycl突变体和野生型子叶的超微结构, 发现野生型叶片的叶绿体形状大多为长椭圆形或梭形, 细胞内数目多(图3E); ycl突变体叶片的叶绿体膨胀成近圆形(图3G)。与野生型相比, ycl突变体的叶绿体结构简单且发育不良, 基粒片层稀疏, 叶绿体内积累了大量的嗜锇体(图5H), 表明黄化致死突变体ycl的叶绿体发育存在明显缺陷。
分别对ycl和XYYH-3-1子叶期叶片进行显微观察, 发现野生型叶片中, 海绵组织与栅栏组织结构饱满、排列有序且紧密(图3A, B); 突变体ycl中, 栅栏组织和海绵组织细胞排列散乱, 缺乏明确的界限, 细胞之间的空隙较大, 叶脉也相对较小(图3C, D), 表明ycl的叶片组织发育异常。用透射电镜(transmission electron microscope, TEM)观察ycl突变体和野生型子叶的超微结构, 发现野生型叶片的叶绿体形状大多为长椭圆形或梭形, 细胞内数目多(图3E); ycl突变体叶片的叶绿体膨胀成近圆形(图3G)。与野生型相比, ycl突变体的叶绿体结构简单且发育不良, 基粒片层稀疏, 叶绿体内积累了大量的嗜锇体(图5H), 表明黄化致死突变体ycl的叶绿体发育存在明显缺陷。
分别对ycl和XYYH-3-1子叶期叶片进行显微观察, 发现野生型叶片中, 海绵组织与栅栏组织结构饱满、排列有序且紧密(图3A, B); 突变体ycl中, 栅栏组织和海绵组织细胞排列散乱, 缺乏明确的界限, 细胞之间的空隙较大, 叶脉也相对较小(图3C, D), 表明ycl的叶片组织发育异常。用透射电镜(transmission electron microscope, TEM)观察ycl突变体和野生型子叶的超微结构, 发现野生型叶片的叶绿体形状大多为长椭圆形或梭形, 细胞内数目多(图3E); ycl突变体叶片的叶绿体膨胀成近圆形(图3G)。与野生型相比, ycl突变体的叶绿体结构简单且发育不良, 基粒片层稀疏, 叶绿体内积累了大量的嗜锇体(图5H), 表明黄化致死突变体ycl的叶绿体发育存在明显缺陷。
分别对ycl和XYYH-3-1子叶期叶片进行显微观察, 发现野生型叶片中, 海绵组织与栅栏组织结构饱满、排列有序且紧密(图3A, B); 突变体ycl中, 栅栏组织和海绵组织细胞排列散乱, 缺乏明确的界限, 细胞之间的空隙较大, 叶脉也相对较小(图3C, D), 表明ycl的叶片组织发育异常。用透射电镜(transmission electron microscope, TEM)观察ycl突变体和野生型子叶的超微结构, 发现野生型叶片的叶绿体形状大多为长椭圆形或梭形, 细胞内数目多(图3E); ycl突变体叶片的叶绿体膨胀成近圆形(图3G)。与野生型相比, ycl突变体的叶绿体结构简单且发育不良, 基粒片层稀疏, 叶绿体内积累了大量的嗜锇体(图5H), 表明黄化致死突变体ycl的叶绿体发育存在明显缺陷。
取ycl及野生型子叶期(7天)植株根、茎和叶, 利用荧光定量PCR对候选区间内CsaV3_3G001980基因进行表达量分析, 发现在根和茎中, ycl基因的表达量极显著低于野生型; 在叶中, 其表达量极显著高于野生型(图5)。CsaV3_3G001980编码NPF (NITRATE TRANSPORTER 1/PEPTIDE TRANSPORTER FAMI- LY)蛋白, 与拟南芥NRT1.5编码基因同源, NRT1.5参与硝酸盐从根到茎的木质部运输, 推测ycl突变体中该基因的表达量下降会影响硝酸盐的运输, 导致叶色发生变化。候选基因CsaV3_3G001980序列全长为6 364 bp, 设计包含启动子区在内的CsaV3_3G001980 gDNA引物, 分段进行克隆测序, 对测序数据拼接并比对, 结果证实未发生基因突变。
BSA混池测序结果显示, 在第18号群体中获得15 323个差异SNP, 在XY子叶群体中获得18 953个差异SNP, 在XY真叶群体中获得20 973个差异SNP, 在3个群体中获得野生亲本纯合、隐性池差异且纯合、显性池纯合或杂合的位点分别有19、51和730个SNP, 以1 000 000 bp为窗口, 100 000 bp为步长, 根据隐性池减去显性池的SNP index作图(图5), 发现3号染色体上SNP密集, 且在3个群体中有重叠。由于与目标性状关联的SNP在染色体上连锁遗传, 故将目的基因初定位在第3号染色体的1.48-1.9 Mb区间, 此候选区段中包含41个蛋白编码基因(表5), 后续将进一步精细定位以获得候选突变位点。
BSA混池测序结果显示, 在第18号群体中获得15 323个差异SNP, 在XY子叶群体中获得18 953个差异SNP, 在XY真叶群体中获得20 973个差异SNP, 在3个群体中获得野生亲本纯合、隐性池差异且纯合、显性池纯合或杂合的位点分别有19、51和730个SNP, 以1 000 000 bp为窗口, 100 000 bp为步长, 根据隐性池减去显性池的SNP index作图(图5), 发现3号染色体上SNP密集, 且在3个群体中有重叠。由于与目标性状关联的SNP在染色体上连锁遗传, 故将目的基因初定位在第3号染色体的1.48-1.9 Mb区间, 此候选区段中包含41个蛋白编码基因(表5), 后续将进一步精细定位以获得候选突变位点。
BSA混池测序结果显示, 在第18号群体中获得15 323个差异SNP, 在XY子叶群体中获得18 953个差异SNP, 在XY真叶群体中获得20 973个差异SNP, 在3个群体中获得野生亲本纯合、隐性池差异且纯合、显性池纯合或杂合的位点分别有19、51和730个SNP, 以1 000 000 bp为窗口, 100 000 bp为步长, 根据隐性池减去显性池的SNP index作图(图5), 发现3号染色体上SNP密集, 且在3个群体中有重叠。由于与目标性状关联的SNP在染色体上连锁遗传, 故将目的基因初定位在第3号染色体的1.48-1.9 Mb区间, 此候选区段中包含41个蛋白编码基因(表5), 后续将进一步精细定位以获得候选突变位点。
BSA混池测序结果显示, 在第18号群体中获得15 323个差异SNP, 在XY子叶群体中获得18 953个差异SNP, 在XY真叶群体中获得20 973个差异SNP, 在3个群体中获得野生亲本纯合、隐性池差异且纯合、显性池纯合或杂合的位点分别有19、51和730个SNP, 以1 000 000 bp为窗口, 100 000 bp为步长, 根据隐性池减去显性池的SNP index作图(图5), 发现3号染色体上SNP密集, 且在3个群体中有重叠。由于与目标性状关联的SNP在染色体上连锁遗传, 故将目的基因初定位在第3号染色体的1.48-1.9 Mb区间, 此候选区段中包含41个蛋白编码基因(表5), 后续将进一步精细定位以获得候选突变位点。
分别对ycl和XYYH-3-1子叶期叶片进行显微观察, 发现野生型叶片中, 海绵组织与栅栏组织结构饱满、排列有序且紧密(图3A, B); 突变体ycl中, 栅栏组织和海绵组织细胞排列散乱, 缺乏明确的界限, 细胞之间的空隙较大, 叶脉也相对较小(图3C, D), 表明ycl的叶片组织发育异常。用透射电镜(transmission electron microscope, TEM)观察ycl突变体和野生型子叶的超微结构, 发现野生型叶片的叶绿体形状大多为长椭圆形或梭形, 细胞内数目多(图3E); ycl突变体叶片的叶绿体膨胀成近圆形(图3G)。与野生型相比, ycl突变体的叶绿体结构简单且发育不良, 基粒片层稀疏, 叶绿体内积累了大量的嗜锇体(图5H), 表明黄化致死突变体ycl的叶绿体发育存在明显缺陷。
分别对ycl和XYYH-3-1子叶期叶片进行显微观察, 发现野生型叶片中, 海绵组织与栅栏组织结构饱满、排列有序且紧密(图3A, B); 突变体ycl中, 栅栏组织和海绵组织细胞排列散乱, 缺乏明确的界限, 细胞之间的空隙较大, 叶脉也相对较小(图3C, D), 表明ycl的叶片组织发育异常。用透射电镜(transmission electron microscope, TEM)观察ycl突变体和野生型子叶的超微结构, 发现野生型叶片的叶绿体形状大多为长椭圆形或梭形, 细胞内数目多(图3E); ycl突变体叶片的叶绿体膨胀成近圆形(图3G)。与野生型相比, ycl突变体的叶绿体结构简单且发育不良, 基粒片层稀疏, 叶绿体内积累了大量的嗜锇体(图5H), 表明黄化致死突变体ycl的叶绿体发育存在明显缺陷。
BSA混池测序结果显示, 在第18号群体中获得15 323个差异SNP, 在XY子叶群体中获得18 953个差异SNP, 在XY真叶群体中获得20 973个差异SNP, 在3个群体中获得野生亲本纯合、隐性池差异且纯合、显性池纯合或杂合的位点分别有19、51和730个SNP, 以1 000 000 bp为窗口, 100 000 bp为步长, 根据隐性池减去显性池的SNP index作图(图5), 发现3号染色体上SNP密集, 且在3个群体中有重叠。由于与目标性状关联的SNP在染色体上连锁遗传, 故将目的基因初定位在第3号染色体的1.48-1.9 Mb区间, 此候选区段中包含41个蛋白编码基因(表5), 后续将进一步精细定位以获得候选突变位点。
取ycl及野生型子叶期(7天)植株根、茎和叶, 利用荧光定量PCR对候选区间内CsaV3_3G001980基因进行表达量分析, 发现在根和茎中, ycl基因的表达量极显著低于野生型; 在叶中, 其表达量极显著高于野生型(图5)。CsaV3_3G001980编码NPF (NITRATE TRANSPORTER 1/PEPTIDE TRANSPORTER FAMI- LY)蛋白, 与拟南芥NRT1.5编码基因同源, NRT1.5参与硝酸盐从根到茎的木质部运输, 推测ycl突变体中该基因的表达量下降会影响硝酸盐的运输, 导致叶色发生变化。候选基因CsaV3_3G001980序列全长为6 364 bp, 设计包含启动子区在内的CsaV3_3G001980 gDNA引物, 分段进行克隆测序, 对测序数据拼接并比对, 结果证实未发生基因突变。
BSA混池测序结果显示, 在第18号群体中获得15 323个差异SNP, 在XY子叶群体中获得18 953个差异SNP, 在XY真叶群体中获得20 973个差异SNP, 在3个群体中获得野生亲本纯合、隐性池差异且纯合、显性池纯合或杂合的位点分别有19、51和730个SNP, 以1 000 000 bp为窗口, 100 000 bp为步长, 根据隐性池减去显性池的SNP index作图(图5), 发现3号染色体上SNP密集, 且在3个群体中有重叠。由于与目标性状关联的SNP在染色体上连锁遗传, 故将目的基因初定位在第3号染色体的1.48-1.9 Mb区间, 此候选区段中包含41个蛋白编码基因(表5), 后续将进一步精细定位以获得候选突变位点。
取ycl及野生型子叶期(7天)植株根、茎和叶, 利用荧光定量PCR对候选区间内CsaV3_3G001980基因进行表达量分析, 发现在根和茎中, ycl基因的表达量极显著低于野生型; 在叶中, 其表达量极显著高于野生型(图5)。CsaV3_3G001980编码NPF (NITRATE TRANSPORTER 1/PEPTIDE TRANSPORTER FAMI- LY)蛋白, 与拟南芥NRT1.5编码基因同源, NRT1.5参与硝酸盐从根到茎的木质部运输, 推测ycl突变体中该基因的表达量下降会影响硝酸盐的运输, 导致叶色发生变化。候选基因CsaV3_3G001980序列全长为6 364 bp, 设计包含启动子区在内的CsaV3_3G001980 gDNA引物, 分段进行克隆测序, 对测序数据拼接并比对, 结果证实未发生基因突变。
取ycl及野生型子叶期(7天)植株根、茎和叶, 利用荧光定量PCR对候选区间内CsaV3_3G001980基因进行表达量分析, 发现在根和茎中, ycl基因的表达量极显著低于野生型; 在叶中, 其表达量极显著高于野生型(图5)。CsaV3_3G001980编码NPF (NITRATE TRANSPORTER 1/PEPTIDE TRANSPORTER FAMI- LY)蛋白, 与拟南芥NRT1.5编码基因同源, NRT1.5参与硝酸盐从根到茎的木质部运输, 推测ycl突变体中该基因的表达量下降会影响硝酸盐的运输, 导致叶色发生变化。候选基因CsaV3_3G001980序列全长为6 364 bp, 设计包含启动子区在内的CsaV3_3G001980 gDNA引物, 分段进行克隆测序, 对测序数据拼接并比对, 结果证实未发生基因突变。
取ycl及野生型子叶期(7天)植株根、茎和叶, 利用荧光定量PCR对候选区间内CsaV3_3G001980基因进行表达量分析, 发现在根和茎中, ycl基因的表达量极显著低于野生型; 在叶中, 其表达量极显著高于野生型(图5)。CsaV3_3G001980编码NPF (NITRATE TRANSPORTER 1/PEPTIDE TRANSPORTER FAMI- LY)蛋白, 与拟南芥NRT1.5编码基因同源, NRT1.5参与硝酸盐从根到茎的木质部运输, 推测ycl突变体中该基因的表达量下降会影响硝酸盐的运输, 导致叶色发生变化。候选基因CsaV3_3G001980序列全长为6 364 bp, 设计包含启动子区在内的CsaV3_3G001980 gDNA引物, 分段进行克隆测序, 对测序数据拼接并比对, 结果证实未发生基因突变。
取ycl及野生型子叶期(7天)植株根、茎和叶, 利用荧光定量PCR对候选区间内CsaV3_3G001980基因进行表达量分析, 发现在根和茎中, ycl基因的表达量极显著低于野生型; 在叶中, 其表达量极显著高于野生型(图5)。CsaV3_3G001980编码NPF (NITRATE TRANSPORTER 1/PEPTIDE TRANSPORTER FAMI- LY)蛋白, 与拟南芥NRT1.5编码基因同源, NRT1.5参与硝酸盐从根到茎的木质部运输, 推测ycl突变体中该基因的表达量下降会影响硝酸盐的运输, 导致叶色发生变化。候选基因CsaV3_3G001980序列全长为6 364 bp, 设计包含启动子区在内的CsaV3_3G001980 gDNA引物, 分段进行克隆测序, 对测序数据拼接并比对, 结果证实未发生基因突变。
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