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一个新的黄瓜叶色突变体鉴定、初定位及转录组分析

赵蔓雅, 孙倩楠, 徐晶晶, 段恬妮, 蔡锦涛, 周婧, 范婷婷, 萧浪涛, 王若仲

植物学报 2025, 60 (4): 515-532. DOI: 10.11983/CBB24112

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叶色突变体是研究光形态发生、叶绿体发育、叶绿素代谢和光合作用机制等多种生理过程的理想材料。该研究从黄瓜(Cucumis sativus) XYYH-2-1-1株系自交后代中获得1个新的黄化致死突变体ycl (yellow cotyledon lethal)。该突变体自幼苗出土后子叶一直呈黄化状态, 约2周后枯萎死亡, 其生长抑制表型为非光依赖型。与野生型相比, ycl突变体的Chl a和Chl b含量趋于零, 叶绿素生物合成途径中Mg²⁺螯合过程受阻。显微和超微结构分析发现, ycl叶片组织紊乱、叶绿体发育受阻。ycl的抗氧化酶活性及丙二醛含量显著升高, 说明其受到氧化胁迫, 且抗氧化能力强。ycl净光合速率极显著降低, 胞间CO₂浓度上升, 推测ycl光合速率降低源于气孔导度降低、叶绿素含量减少和叶绿体发育受阻。转录组学分析表明, ycl与其野生型间存在337个差异表达基因, 光合作用、类黄酮生物合成、叶绿素代谢和活性氧代谢是导致ycl黄化致死表型形成的关键途径。通过BSA-Seq分析, ycl突变基因初步定位于3号染色体的1.48-1.9 Mb区间, 内含41个候选基因。对ycl突变体的研究为阐明黄瓜叶绿体发育的分子机制提供了参考。

Primer name	Forward primer (5′→3′)	Reverse primer (5'→3')
Cs-Actin	GTTACGCCCTCCCTCATGCCATTC	TCCCGTTCGGCAGTGGTGGT
CsaV3_3G002180	GTCGTCCTGCCATTCGATCA	AGCACCAAGTTCACTCCAACT
CsaV3_5G025230	AATTCTTCCGACCCGAACCC	AGTAGCCTTCTGCGGACCTA
CsaV3_1G030370	CAGTGGCTGGATACGTCCTC	GTGAGCTCCCGCCATAAAGT
CsaV3_7G000620	TGGAGCATCTCCGAAAGTGG	GGCAAGGAATTGTGATGCCA
CsaV3_5G028880	TAGAACCCAGGCTCCCTCAA	CCGTGTTTTCACAAGCTTCTCT
CsaV3_3G041340	AACATGTTACTGGTGGGGGC	CACATTGAAATCATTGGGTACCTG
CsaV3_6G037230	CCCACTCAAGCGATGTG CTA	CCATTGACCTCAGCATTGCG
CsaV3_5G006200	GACCCAGTTCAAGCTAGCCA	ACTGAGACAACAAGCGCGTA
CsaV3_7G008610	GGCTCCAAGGGCCAATACAT	GTAGGCCTTGGACAGGCATT

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表1 qRT-PCR引物

正文中引用本图/表的段落

收集长势良好的XYYH-3-1以及ycl子叶期根、茎、叶, 取样时用ddH₂O冲洗根部土壤, 滤纸吸干后立即放入液氮中速冻保存。采用美基生物HiPure Plant RNA Mini Kit (多糖多酚)提取RNA。用莫纳生物MonScript? RTIII All-in-One Mix with dsDNase试剂盒进行反转录。引物设计参考葫芦科作物基因组数据库网站(http://cucurbitgenomics.org/)上介绍的方法, 并使用NCBI的Primer BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi)确定引物的质量与特异性, 委托生工生物工程股份有限公司合成(表1)。cDNA合成后, 以Cs- Actin为内参基因, 对反转录合成的cDNA进行RT- PCR检测, 合格后使用诺唯赞ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix进行实时荧光定量PCR (qRT- PCR)。将反转录得到的cDNA, 根据半定量RT-PCR结果稀释2-10倍作为模板, 以减少cDNA浓度过高造成的误差。以Cs-Actin为内参基因, 根据Threshold cycle (Cq/Ct)值, 采用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量(Schmittgen and Livak, 2008)。

(A) 4、5、6、7、8和14天野生型(WT)和ycl表型变化(自然光); (B) 第7天苗龄时2组WT和ycl表型差异(黑暗处理7天); (C) 第8天苗龄时2组WT和ycl表型差异(光照培养1天)。Bars=1 cm

本研究利用XYYH-2-1-1株系进行自交, 构建了18个分离群体, 第3号群体XYYH-3-1的绿叶表型能稳定遗传, 作为野生型; 其余17个群体自交后代能分离出黄化苗, 作为杂合株, 其中第18号群体共22株, 正常绿苗与黄化致死苗的比值为3:1, 经卡方检验(χ2=0.088 9, P>0.05)符合孟德尔遗传规律。观察ycl与XYYH-3-1在种子萌发过程中, 黑暗处理对其生长发育及叶色的影响。黑暗培养7天后突变体ycl及其野生型XYYH-3-1子叶皆呈黄色, ycl表现出不同程度的发育缺陷, 下胚轴长度显著低于野生型, 根系长度较野生型短(图1B)。光照培养1天后叶片逐渐展开, 野生型子叶转绿, ycl叶色无变化(图1C), 由此推测ycl的生长抑制表型为非光依赖型。

为进一步揭示黄化致死表型形成的原因, 对高度相关的差异表达基因进行筛选分析。在转录组差异表达基因中, 发现5个参与光合作用的关键基因(图7A), 分别为1个编码叶绿素a/b结合蛋白(chlorophyll a/b binding protein, LHCP)的基因、2个编码质体蓝素(plastocyanin, PC)的基因、1个编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)且富集于光合生物中的碳固定基因和1个编码叶绿素酶1 (Chlase 1)的基因。与野生型相比, 前4个基因在突变体ycl中表达下调, 后1个基因表达上调。

转录组测序(RNA-Seq)分析结果中, 部分DEGs富集在氧化还原酶活性、氧化还原过程和类囊体膜基质侧, 说明突变株体内ROS含量过高, 而ROS作为信号分子调控叶绿素合成基因表达, 导致叶绿体类囊体膜结构的稳定性及叶绿素含量显著降低。这与通过透射电镜观察到的叶绿体结构发育异常一致, 也与ycl子叶期SOD和POD活性及MDA含量显著高于野生型相符。Du等(2020)发现岷江百合(Lilium regale)突变体lrysl1中调控光合途径的CP43和PetE等基因下调会导致光合系统受损, 最终呈现黄化致死表型。本研究中突变体ycl亦有参与光合途径的DEGs, 如编码叶绿素a/b结合蛋白的基因LHCP和富集在光合作用天线蛋白上的基因PC。ycl中LHCP和PC等基因显著下调表达, 直接削弱了光能捕获与电子传递能力, 导致光合效率极低以及最终上游的叶绿素合成异常; 而叶绿素酶1表达上调, 加速了下游的叶绿素降解, 二者共同造成叶绿素积累受阻, 导致叶绿素含量趋近于零。同时, 极低的光合效率导致ATP供应不足, 削弱了SOD和POD的抗氧化能力, ROS进一步破坏叶绿体结构, 加剧了代谢紊乱, 这一机制暗示ycl可能代表一种新型的非光依赖型致死调控模块。

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