图/表详细信息

基因编辑技术在玉米中的研究进展

张强, 赵振宇, 李平华

植物学报 2024, 59 (6): 978-998. DOI: 10.11983/CBB24080

摘要（324）

HTML （24）

PDF（pc）（1388KB）（1342）

基因编辑技术已成为现代农业育种领域的重要工具。玉米(Zea mays)是全球最重要的粮食作物之一, 基因编辑技术在玉米中的应用显示出巨大的潜力。该文综述了基因编辑技术在玉米研究中的应用进展, 重点介绍了CRISPR/Cas等系统在玉米基因组编辑中的最新成果。首先, 介绍了基因编辑技术的基本原理和类型, 特别是CRISPR/Cas系统的工作机制及其在玉米中的应用优势。其次, 总结了基因编辑技术在玉米育种中的研究进展, 涵盖从基础的基因组编辑到复杂的多基因编辑, 旨在改良玉米的产量、品质和抗逆性等关键性状。最后, 文章列举了我国在玉米基因编辑方面的杰出工作, 并讨论了基因编辑技术应用于玉米育种中存在的问题, 同时展望了未来发展方向。

应用	靶标基因	基因功能	性状改良	参考文献
单倍体诱导	ZmPLA1	编码特异性磷脂酶	单倍体诱导	Dong et al., 2018
	ZmDMP	单倍体诱导	单倍体诱导	Liu et al., 2017
	CENH3	单倍体诱导	单倍体诱导	Wang et al., 2021a
雄性不育	MS45	编码异胡豆苷合成酶类似蛋白	花粉发育异常, 雄性不育	Svitashev et al., 2015
	MS8	编码β-1,3-半乳糖基转移酶	花粉发育异常, 雄性不育	Chen et al., 2018
	ZmABCG2和ZmFAR1	角质层减少和蜡质含量增加	花粉发育异常, 雄性不育	Jiang et al., 2021
	ZmTMS5	编码RNase Z蛋白	温敏雄性不育植株	Li et al., 2017b
	Dcl5	产生多样化的24 nt phasiRNAs	温敏雄性不育植株	Teng et al., 2020
株型	CLE7和FCP1	控制分生组织大小	果穗行数和籽粒产量增加, 果穗变大, 叶夹角减小	Liu et al., 2021
	ZmLg1	编码调控SBP结构域蛋白	叶夹角减小, 种植密度增大	Li et al., 2017a
	SAMBA	影响有丝分裂期推进复合体	节间缩短, 上部叶片缩小、直立, 叶片整体缩小	Gong et al., 2022
	ZmRAVL1	影响油菜素内酯信号通路	叶夹角变小	刘杰和严建兵, 2019
激素	GA20ox3	赤霉素合成	半矮生	Zhang et al., 2020a
	ZmACO2	乙烯合成	促进花序和花发育, 增加穗重	Ning et al., 2021
	ZmCEP1	肽激素合成	降低植株和穗高度、穗长、籽粒大小和百粒重	Xu et al., 2021
	CKX	细胞分裂素氧化酶合成	细胞分裂和植物器官的形成	刘超等, 2020
果穗	Zm079、Zm080和Zm081	调控百粒重	增加穗重、穗长和穗粗	穆路遥, 2022
光合作用	Zmcst1	影响气孔开放和光合作用	叶片提前衰老	Wang et al., 2019a
	qkw9	光合作用减弱	为籽粒充实提供的母体光合产物减少	Huang et al., 2020
	ZmSWEET13	光合作用受损	叶片中可溶性糖和淀粉含量增加	Bezrutczyk et al., 2018
	ANT1	光合作用受损	相互遮荫	Liu et al., 2020
	Zmpif3、Zmpif4和Zmpif5	调控光信号和光形态发生	减弱植株对遮荫环境的响应	Wu et al., 2019
香味	ZmBADH2a和mBADH2b	控制2-乙酰基-1-吡咯烷酮合成	挥发物含量增加, 香气增加	Wang et al., 2021b; 张翔等, 2021; 王彦晓, 2021
甜味	Zmsh2	编码AGPase酶	甜玉米	Dong et al., 2019; 祁显涛, 2019
糯性	SH2和WX	编码AGPase酶和GBSS酶	甜玉米和糯玉米	Gao et al., 2020; Qi et al., 2020
抗倒伏	ZmWx1	编码GBSS酶	纤维素和木质素含量增加	Li et al., 2020
	stiff1	控制纤维素和木质素含量	秸秆强度增加	Zhang et al., 2020b
	qpa1	半矮化	株高和穗位降低, 茎粗增加, 叶片更直立	Wei et al., 2018
	ZmPHYCs	减弱避荫综合症	降低植株高度和穗位高度	Li et al., 2020
干旱	ARGOS8	乙烯响应负调控因子	提高耐旱能力	Shi et al., 2017
	ZmHDT103	编码乙酰化酶	提高耐旱能力	Wang et al., 2024
	ZmSRL5	编码CALSP蛋白	提高耐旱能力	Pan et al., 2020
抗除草剂	ZmEPSPS	抑制叶绿体中5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的作用	抗除草剂	Kaul et al., 2024
	ALS2	编码乙酰乳酸合成酶	抗除草剂	Svitashev et al., 2015, 2016; Li et al., 2020; Jiang et al., 2020
病原侵染	ZmLox3	编码脂肪氧化酶	抗黑粉菌	Pathi et al., 2020
	ZmGDlα	编码RabGDP解离抑制因子	抗粗缩病	Liu et al., 2022
	ZmCOI1a和ZmJAZ15	茉莉酸合成	抗茎腐病	Ma et al., 2021
	ZmFBL41	E3泛素连接酶复合体的成员之一	抗纹枯病	李伟滔等, 2019

View table in article

表2 基因编辑技术在玉米改良中的应用

正文中引用本图/表的段落

基因编辑技术的发展为玉米育种带来了划时代的变革。通过精准地编辑玉米基因组, 能够培育出产量更高、抗逆性更强且营养更丰富的玉米新品种(何晓玲等, 2022)。基因编辑技术不仅极大地缩短了玉米的育种周期, 降低了研发成本, 而且能够在维持玉米遗传优势的基础上, 精确地改良其特定性状。基因编辑技术的应用为玉米产业的可持续发展注入了新活力, 为全球粮食安全提供了有力保障。下文将系统总结CRISPR/Cas9技术在玉米多个关键领域的应用, 包括增加产量、优化品质、增强生物与非生物胁迫抗性以及在不育系创制和单倍体诱导等方面的应用进展(表2)。

在自然条件下, 大多数植物(如玉米)表现为二倍体, 即每个细胞含有2套染色体。为培育出遗传上纯合的系谱, 研究人员通过多代连续自交以确保后代基因的纯合性。而单倍体诱导技术提供了一种更为高效的方法。该技术通过特定的双单倍体(DH)途径, 诱导植物产生仅含1套染色体的细胞, 进而发育成单倍体植株。随后, 利用染色体加倍技术, 将单倍体植株转化为遗传稳定的二倍体植株, 极大地缩短了培育纯合谱系的时间(Ren et al., 2017)。基于CRISPR/Cas9技术对玉米中的花粉特异性磷脂酶基因ZmPLA1进行精确编辑, Dong等(2018)成功开发出高效的孤雌生殖单倍体诱导体系; 他们还融入一个组织特异性表达的双荧光蛋白标记系统, 显著优化了单倍体的鉴别和筛选流程, 极大地提高了筛选效率, 并为作物改良中双单倍体育种技术的应用确立了新标准。Stock6 (可诱导产生单倍体的玉米突变体)作为玉米单倍体诱导育种的关键工具, 可通过杂交诱发孤雌生殖, 即使花粉与雌蕊接触, 也不形成正常的双倍体合子, 而是直接形成单倍体种子, 随后通过化学处理或温度震荡等手段进行染色体加倍, 进而形成遗传上纯合的双单倍体植株。Liu等(2017)利用CRISPR/Cas9技术对玉米ZmPLA1基因第1外显子进行精确编辑, 导致特定的缺失突变。编辑后的突变体平均单倍体诱导率约为2%, 与Stock6的诱导效率相似。该研究团队进一步采用CRISPR/Cas9技术敲除ZmDMP基因后, 观察到该基因缺失单倍体诱导率提高5-6倍。这是首次在非Stock6背景下观察到的独立单倍体诱导现象, 展现出基因编辑技术在提高单倍体诱导率方面的巨大应用潜力。通过将CRISPR/Cas9基因编辑技术与传统单倍体诱导策略相结合, 创制了单倍体诱导编辑(haploid-induction editing, HI-Edit)策略(Kelliher et al., 2019)和单倍体诱导介导的基因组编辑(haploid inducer-mediated genome editing, IMGE)策略(Wang et al., 2019a)。利用单倍体诱导技术可以高效生成单倍体植株, 随后通过CRISPR/Cas9或其它基因编辑技术进行目标基因的精确修改。HI-Edit策略的独特之处在于, 允许在不引入外源DNA的条件下对基因进行精准改良, 因此显著降低了对转基因技术的依赖。通过这种策略, 可在2个世代内成功培育出特定性状的纯合株系。此外, 该策略有效克服了玉米遗传转化过程中的基因型限制, 为玉米育种提供了更广泛的适用范围。在真核生物中, 着丝粒是染色体准确分离与遗传信息传递不可或缺的区域, 而特异的着丝粒组蛋白CH3 (CENH3)在识别和维持着丝粒染色质结构方面扮演着关键角色。Wang等(2021a)通过CRISPR/Cas9技术对玉米CENH3基因进行编辑, 成功创制了一个由单碱基缺失引起编辑提前终止的突变体。该突变体与野生型进行杂交后, 自交时纯合的突变体具有高度致死性, 无法通过配子传递, 而杂合子与野生型进行正反交配, 后代为单倍体或非整倍体。这表明CENH3突变可通过一次杂交转移到其它品系中, 为构建高效且简化的玉米单倍体诱导系统提供了可能。

玉米植株的形态特征如密植耐受性、茎秆强度、植株高度、叶片夹角和穗位高度, 对于玉米光合效率和空间资源利用具有决定性作用, 并直接影响产量。因此, 在玉米育种和农业生产实践中, 株型优化是提高产量和作物适应性的关键因素。在玉米发育初期, 特别是在9至10叶期, 位于叶腋的分生组织(AM)转变为花序分生组织(IM), 继而在IM上发育出多行小穗分生组织(SPM)。而分生组织的生长和发育主要受CLAVATA- WUSCHEL信号途径中CLE肽信号调控, 此途径是果穗行数及粒重增加的关键(Schoof et al., 2000)。Liu等(2021)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术, 对玉米中CLV3的同源基因CLE7和FCP1的启动子区进行特定的缺失编辑, 发现突变体中分生组织显著增大, 从而间接提高玉米产量相关性状, 如穗大小、粒数及百粒重。叶夹角是影响玉米密植的关键因子, 优化叶夹角不仅能提高光利用效率, 还可改善作物群体的空气流通, 最终提高群体光合效率。Li等(2017a)利用CRISPR/Cas9对玉米ZmLg1基因进行编辑, 该基因编码一种含SBP (squamosa promoter-binding protein)结构域的蛋白, 负责调控叶夹角。通过对ZmLg1基因第1外显子进行编辑, T₀代植株展现出高达51.5%-91.2%的基因编辑效率, 并使叶夹角明显变小至对照组的50%, 且突变特征稳定遗传。田间试验表明, 这些突变体通过增加种植密度展现出增产潜力。SAMBA作为植物特异性调节因子, 是影响拟南芥有丝分裂期推进复合体(APC/C)的关键因子, 负责控制细胞周期的顺利进行。研究发现, SAMBA与APC/C在玉米中同样存在相互作用, 通过对玉米中2个SAMBA基因敲除突变体的观察, 发现一系列生长缺陷, 包括节间缩短、上部叶片缩小和直立以及叶片整体缩小(Gong et al., 2022)。玉米中功能基因brd1和ZmRAVL1通过油菜素内酯信号通路调控叶夹角。UPA2定位于ZmRAVL1上游, 具有与DRL1蛋白结合的能力。LG1蛋白参与调控玉米叶夹角, 能激活ZmRAVL1的表达。DRL1与LG1直接相互作用, 抑制LG1对ZmRAVL1的激活。相较于玉米, 其祖先种大刍草(Zea mays subsp. parviglumis)的UPA2位点与DRL1蛋白结合能力更强, 导致ZmRAVL1表达显著受抑制, 进而下调其下游基因brd1的表达, 降低叶环区内源BR水平, 使叶夹角变小。将大刍草UPA2等位基因导入玉米或对玉米中的ZmRAVL1进行编辑, 在密植条件下均可显著提高玉米的产量(刘杰和严建兵, 2019)。

植物激素在玉米整个生命周期中扮演重要角色。赤霉素、生长素、细胞分裂素、乙烯、脱落酸、茉莉酸和水杨酸等植物激素通过复杂的相互作用和信号转导网络, 构成一个高度精密的调控系统。“绿色革命”基因赤霉素氧化酶基因GA20ox对于促进半矮表型的形成起重要作用, 不仅提高作物产量, 同时增强了植株的抗倒伏能力。Zhang等(2020a)利用CRISPR/Cas9技术编辑玉米GA20ox3基因后, 突变体中GA₁₂和GA₅₃的含量升高, 而其它GA前体的含量显著降低, 成功培育出半矮型玉米, 并在T₂代植株中筛选出无转基因矮秆玉米。在玉米生长发育中, 细胞分裂素氧化酶(cytokinin oxidase, CKX)起关键作用, 其通过降解细胞分裂素调节植物激素水平。刘超等(2020)从玉米B73的基因组数据中成功鉴定出3个穗发育关键基因。使用e-crisp设计特异性sgRNA后, 采用密码子优化的CRISPR/Cas9系统, 成功构建了CKX基因的植物表达载体p3301-U6P-sgRNA-Ubi-Cas9, 为创制基因敲除玉米突变体奠定了基础。Ning等(2021)对数量性状基因座qEL7进行鉴定, 发现该基因座控制玉米的果穗长、花朵数和生育力等。qEL7编码的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶2 (ACO2)是乙烯生物合成过程中的关键酶, 在发育中的花序特定区域呈现特异性表达。通过编辑ZmACO2基因验证了qEL7的功能, 发现该编辑减少了发育中果穗的乙烯产生, 促进花序和花的发育, 从而提高产量。C末端编码肽(CEPs)是一类重要的肽激素, 其在拟南芥和水稻中通过细胞间通信调节植物生长和非生物胁迫响应, 而其在玉米中的作用仍知之甚少。Xu等(2021)探讨了玉米ZmCEP1的时空表达模式, 发现其可能调节生长素(auxin)等植物激素的运输和分布, 进而影响籽粒细胞的分裂和扩张, 为玉米籽粒改良提供了新的靶点和思路。

气孔运动通过调节CO₂的可用性影响植物的光合速率, 这一过程受到光合产物的反馈调节。然而, 在单子叶作物中, 该调节回路的遗传组分和机制尚待进一步阐明。Wang等(2019b)基于图位克隆CST1并通过CRISPR/Cas9系统, 发现导致CST1蛋白E81K突变的是一种属于Clade I SWEET (Sugars Will Eventually be Exported Transporters)家族的基因突变。CST1编码一个在附属细胞中表达的功能性葡萄糖转运蛋白。E81K突变破坏了CST1蛋白的寡聚化能力及其葡萄糖转运活性, 导致气孔开度减小、碳饥饿以及叶片提前衰老。此外, 一个含有DYW基序的五肽重复蛋白(pentatricopeptide repeat protein, PPR)参与叶绿体NADH脱氢酶复合体ndhB亚基C到U的编辑。Huang等(2020)利用CRISPR/Cas9技术对qkw9基因进行敲除, 在qkw9的空白背景下, ndhB的C到U编辑被抑制, 光合作用减弱。作物产量的形成依赖于从叶片到种子的蔗糖高效分配。ZmSWEET13旁系同源体(Zmsweet13a、Zmsweet13b和Zmsweet13c)是叶片中表达量最高的基因之一。Bezrutczyk等(2018)通过基因编辑进行三重敲除, 突变体表现严重的生长受阻, 光合机构受损, 叶片积累大量可溶性糖和淀粉, 且RNA-seq数据揭示突变体中与光合作用和碳水化合物代谢相关的基因发生转录失调。ANT (AINTEGUMENTA)是一种AP2转录因子, 在植物生长和花器官形成中起重要作用。Liu等(2020)利用CRISPR/Cas9技术生成1个单密码子缺失突变体和2个ANT1同源基因移码突变体。这2个移码突变体与野生型(WT)相比, 表现出植物光合效率和生长速率降低及叶面积变小。在高密度种植条件下, 玉米植株之间相互遮挡, 导致底部叶片光照强度降低, 进而影响红光与远红光的比例, 最终降低产量。为解释该现象的分子机制, Wu等(2019)利用CRISPR/Cas9技术对玉米中参与光信号传递和光依赖形态建成的PIF基因家族成员Zmpif3、Zmpif4和Zmpif5进行敲除, 发现在黑暗条件下生长的突变体幼苗的中胚轴伸长被严重抑制, 且对模拟遮荫处理的响应减弱。

2-乙酰基-1-吡咯烷酮(2AP)是从芳香型水稻中鉴定出的200多种挥发性物质中的关键风味化合物。除水稻外, 多种植物中都存在天然的芳香物质, 通常表现出较低的甜菜碱醛脱氢酶2 (BADH2)活性。Wang等(2021b)对玉米BADH2同源基因ZmBADH2a和ZmBADH2b进行CRISPR/Cas敲除, 生成ZmBADH2a和ZmBADH2b双基因突变体。在双突变体中, 无论是新鲜籽粒还是干燥成熟种子, 其2AP含量均升高。此外, 张翔等(2021)利用CRISPR/Cas9技术在玉米4号染色体ZmBADH2-1和1号染色体ZmBADH2-2进行精确敲除, 双基因突变体籽粒中的2AP含量与芳香型水稻相似, 由此创制出具有类似香米香气的新型玉米种质。王彦晓(2021)选取包括郑58、糯型玉米N355、XCW175及LN005M等在内的多种普通及特殊玉米品种进行研究, 利用构建的3种CRISPR/Cas系统载体对BADH2基因进行编辑, 并通过农杆菌介导法将这些载体导入玉米幼胚中, 培育出多个带有香气的玉米自交系新品种。

茎秆倒伏性由茎秆强度决定, 且是限制高密度种植条件下玉米产量的关键因素。然而, 玉米茎秆强度的分子遗传基础复杂, 导致改良方法效率低。在玉米茎秆发育中, STIFF1基因扮演关键角色。Zhang等(2020b)采用CRISPR/Cas9技术编辑STIFF1基因的特定等位基因, 进一步提高了玉米茎秆的纤维素和木质素含量。sd1和Rht1等半矮化基因在水稻和小麦中的应用促发第一次“绿色革命”。在玉米中, 尚未发现能有效降低株高但不降低产量性状的半矮化基因。利用CRISPR/Cas技术, Wei等(2018)精确鉴定到编码P-糖蛋白的Brachytic2基因(qpa1)的新等位基因。并在qpa1基因的最后一个外显子中引入241 bp缺失, 突变体表现为不降低产量但显著降低株高和穗位以及增加茎粗。在光照条件下, 玉米PHYC2蛋白定位于细胞核和细胞质, 且能够与自身或PHYBs相互作用。异源表达ZmPHYCs能够补偿拟南芥phyC-2突变体在持续红光条件下的表型。Li等(2020)利用CRISPR/ Cas9技术创建了ZmPHYC1和ZmPHYC2双基因敲除突变体, 在长日照条件下该突变体表现出中等程度的早花表型, 而过表达ZmPHYC2植株表现出株高和穗位中度降低。

在自然条件下, 大多数植物(如玉米)表现为二倍体, 即每个细胞含有2套染色体.为培育出遗传上纯合的系谱, 研究人员通过多代连续自交以确保后代基因的纯合性.而单倍体诱导技术提供了一种更为高效的方法.该技术通过特定的双单倍体(DH)途径, 诱导植物产生仅含1套染色体的细胞, 进而发育成单倍体植株.随后, 利用染色体加倍技术, 将单倍体植株转化为遗传稳定的二倍体植株, 极大地缩短了培育纯合谱系的时间(Ren et al., 2017).基于CRISPR/Cas9技术对玉米中的花粉特异性磷脂酶基因ZmPLA1进行精确编辑, Dong等(2018)成功开发出高效的孤雌生殖单倍体诱导体系; 他们还融入一个组织特异性表达的双荧光蛋白标记系统, 显著优化了单倍体的鉴别和筛选流程, 极大地提高了筛选效率, 并为作物改良中双单倍体育种技术的应用确立了新标准.Stock6 (可诱导产生单倍体的玉米突变体)作为玉米单倍体诱导育种的关键工具, 可通过杂交诱发孤雌生殖, 即使花粉与雌蕊接触, 也不形成正常的双倍体合子, 而是直接形成单倍体种子, 随后通过化学处理或温度震荡等手段进行染色体加倍, 进而形成遗传上纯合的双单倍体植株.Liu等(2017)利用CRISPR/Cas9技术对玉米ZmPLA1基因第1外显子进行精确编辑, 导致特定的缺失突变.编辑后的突变体平均单倍体诱导率约为2%, 与Stock6的诱导效率相似.该研究团队进一步采用CRISPR/Cas9技术敲除ZmDMP基因后, 观察到该基因缺失单倍体诱导率提高5-6倍.这是首次在非Stock6背景下观察到的独立单倍体诱导现象, 展现出基因编辑技术在提高单倍体诱导率方面的巨大应用潜力.通过将CRISPR/Cas9基因编辑技术与传统单倍体诱导策略相结合, 创制了单倍体诱导编辑(haploid-induction editing, HI-Edit)策略(Kelliher et al., 2019)和单倍体诱导介导的基因组编辑(haploid inducer-mediated genome editing, IMGE)策略(Wang et al., 2019a).利用单倍体诱导技术可以高效生成单倍体植株, 随后通过CRISPR/Cas9或其它基因编辑技术进行目标基因的精确修改.HI-Edit策略的独特之处在于, 允许在不引入外源DNA的条件下对基因进行精准改良, 因此显著降低了对转基因技术的依赖.通过这种策略, 可在2个世代内成功培育出特定性状的纯合株系.此外, 该策略有效克服了玉米遗传转化过程中的基因型限制, 为玉米育种提供了更广泛的适用范围.在真核生物中, 着丝粒是染色体准确分离与遗传信息传递不可或缺的区域, 而特异的着丝粒组蛋白CH3 (CENH3)在识别和维持着丝粒染色质结构方面扮演着关键角色.Wang等(2021a)通过CRISPR/Cas9技术对玉米CENH3基因进行编辑, 成功创制了一个由单碱基缺失引起编辑提前终止的突变体.该突变体与野生型进行杂交后, 自交时纯合的突变体具有高度致死性, 无法通过配子传递, 而杂合子与野生型进行正反交配, 后代为单倍体或非整倍体.这表明CENH3突变可通过一次杂交转移到其它品系中, 为构建高效且简化的玉米单倍体诱导系统提供了可能. ...

本文的其它图/表