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根癌农杆菌介导万寿菊遗传转化体系的建立
植物学报
2023, 58 (5):
760-769.
DOI: 10.11983/CBB22141
以万寿菊(Tagetes erecta)里程碑·黄色的小叶为外植体, 采用农杆菌介导法探究抗生素浓度、菌株类型、菌液浓度、侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度和抗褐化剂种类对万寿菊遗传转化效率的影响。结果表明, 头孢霉素(Cef)和硫酸卡那霉素(Kan)的适宜浓度分别为100 mg·L-1和10 mg·L-1; EHA105菌株的稳定转化效率最高; 菌液浓度OD600=0.1、侵染5分钟及共培养1天为最佳侵染条件。此外, 在侵染过程中添加100 µmol·L-1乙酰丁香酮(AS)和筛选培养基中添加0.2 g·L-1聚乙烯吡咯烷酮(PVP)均能提高出芽率。经GUS染色、PCR检测以及Southern blot检测证明转化成功, 转化效率达到4%左右。研究结果为万寿菊基因功能研究和转基因育种奠定了基础。
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图5
万寿菊抗性苗PCR检测及Southern blot验证
(A) 抗性苗PCR扩增检测(M: 2000 DNA分子量标准; 1: ddH2O; 2: 质粒; 3, 4: 阴性对照, 即未侵染的叶片DNA; 5-15: 抗性苗DNA); (B) 阳性苗Southern blot检测(用HindIII酶切, 以NPT-II为探针。M: DNA分子量标准; 1: 阴性对照, 即未侵染的叶片DNA; 2: 阳性对照, 即质粒; 3-5: 阳性苗DNA)。
正文中引用本图/表的段落
按照遗传转化流程(图3)筛选最佳转化条件。将获得的抗性苗用GUS染液染色, 同时以未侵染的植株进行染色作为阴性对照, 结果观察到阳性苗的小叶、花瓣、柱头、胚以及苞片等部位均被染成蓝色, 而阴性对照未染色(图4)。抗性苗继代后进行移栽, 15天后取叶片提取DNA, 进行PCR扩增检测。能扩增出581 bp条带的为阳性苗(图5A)。为了进一步验证转化是否成功, 随机选取GUS染色呈蓝色的植株进行Southern blot检测, 结果显示分别有1个和3个拷贝, 证明T-DNA已被整合到万寿菊基因组中, 即转化成功(图5B)。
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