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根癌农杆菌介导万寿菊遗传转化体系的建立

余晓敏, 王亚琴, 刘雨菡, 易庆平, 程文翰, 朱钰, 段枫, 张莉雪, 何燕红

植物学报 2023, 58 (5): 760-769. DOI: 10.11983/CBB22141

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以万寿菊(Tagetes erecta)里程碑·黄色的小叶为外植体, 采用农杆菌介导法探究抗生素浓度、菌株类型、菌液浓度、侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度和抗褐化剂种类对万寿菊遗传转化效率的影响。结果表明, 头孢霉素(Cef)和硫酸卡那霉素(Kan)的适宜浓度分别为100 mg·L^-1和10 mg·L^-1; EHA105菌株的稳定转化效率最高; 菌液浓度OD₆₀₀=0.1、侵染5分钟及共培养1天为最佳侵染条件。此外, 在侵染过程中添加100 µmol·L^-1乙酰丁香酮(AS)和筛选培养基中添加0.2 g·L^-1聚乙烯吡咯烷酮(PVP)均能提高出芽率。经GUS染色、PCR检测以及Southern blot检测证明转化成功, 转化效率达到4%左右。研究结果为万寿菊基因功能研究和转基因育种奠定了基础。

Culture medium types	Formula
MS	4.405 g·L^-1 MS+30 g·L^-1 sucrose+8 g·L^-1 agar
Regeneration medium	4.405 g·L^-1 MS+40 g·L^-1 sucrose+8 g·L^-1 agar+0.2 mg·L^-1 TDZ+0.5 mg·L^-1 IBA
Co-culture medium	4.405 g·L^-1 MS+40 g·L^-1 sucrose+8 g·L^-1 agar+0.2 mg·L^-1 TDZ+0.5 mg·L^-1 IBA+0.5 g·L^-1 MES+ 100 μmol·L^-1 AS
Screening medium	4.405 g·L^-1 MS+40 g·L^-1 sucrose+8 g·L^-1 agar+0.2 mg·L^-1 TDZ+0.5 mg·L^-1 IBA+0.5 g·L^-1 MES+10 mg·L^-1 Kan+100 mg·L^-1 Cef
Elongation medium/ rooting medium	4.405 g·L^-1 MS+30 g·L^-1 sucrose+8 g·L^-1 agar+0.5 g·L^-1 MES+10 mg·L^-1 Kan+100 mg·L^-1 Cef

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表1 万寿菊里程碑·黄色遗传转化培养基

正文中引用本图/表的段落

万寿菊(Tagetes erecta L.)里程碑·黄色购于赤峰塞诺园艺有限公司。EHA105农杆菌感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。pBI121质粒由华中农业大学园艺林学学院王彩云教授课题组惠赠。试验所用培养基见表1。

(A) 3种菌株的GUS基因瞬时表达和抗性愈伤组织示意图(bars=1 cm); (B) 菌株类型对GUS基因瞬时表达效率及抗性愈伤组织诱导效率的影响(相同颜色柱形图上不同小写字母表示在0.05水平差异显著)

由表4可知, 抗性芽的平均出芽率约为16.15%, 高于平均出芽率的处理组合有8个, 其中2、5、9和11号处理出芽率均高于6号处理, 但芽后期多褐化、玻璃化或表现为假阳性, 无阳性苗产生。1号和6号处理出芽率较高, 阳性率也较高。以PCR阳性率作为评定指标, 比较3个因素的极差R (表5), 发现3个因素中影响转化效率的主次程度为共培养时间>侵染时间>菌液浓度。根据各因素水平对应的均值大小, 确定OD₆₀₀=0.1、侵染5分钟及共培养1天为最佳转化条件。

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