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根癌农杆菌介导万寿菊遗传转化体系的建立

余晓敏, 王亚琴, 刘雨菡, 易庆平, 程文翰, 朱钰, 段枫, 张莉雪, 何燕红

植物学报 2023, 58 (5): 760-769. DOI: 10.11983/CBB22141

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以万寿菊(Tagetes erecta)里程碑·黄色的小叶为外植体, 采用农杆菌介导法探究抗生素浓度、菌株类型、菌液浓度、侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度和抗褐化剂种类对万寿菊遗传转化效率的影响。结果表明, 头孢霉素(Cef)和硫酸卡那霉素(Kan)的适宜浓度分别为100 mg·L^-1和10 mg·L^-1; EHA105菌株的稳定转化效率最高; 菌液浓度OD₆₀₀=0.1、侵染5分钟及共培养1天为最佳侵染条件。此外, 在侵染过程中添加100 µmol·L^-1乙酰丁香酮(AS)和筛选培养基中添加0.2 g·L^-1聚乙烯吡咯烷酮(PVP)均能提高出芽率。经GUS染色、PCR检测以及Southern blot检测证明转化成功, 转化效率达到4%左右。研究结果为万寿菊基因功能研究和转基因育种奠定了基础。

Cef concentration (mg·L^-1)	Callus induction rate (%)	Regeneration rate (%)	Growth of bacteria
0	100.00±0.00 a	60.00±8.16 a	Grow well
100	97.50±5.00 a	47.50±12.58 ab	Completely inhibited
200	97.50±5.00 a	40.00±8.16 abc	Completely inhibited
300	65.00±5.77 b	35.00±12.91 bc	Completely inhibited
400	37.50±12.58 c	37.50±17.08 bc	Completely inhibited
500	27.50±5.00 c	27.50±12.58 c	Completely inhibited

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表3 不同浓度Cef对万寿菊小叶再生和菌落生长的影响

正文中引用本图/表的段落

菌株类型对转化效率的影响: 将万寿菊小叶分别经EHA105、GV3101和LBA4404三种农杆菌侵染后正面向上接种于共培养基上, 暗培养2天后, 选一部分小叶进行GUS瞬时表达检测, 统计GUS瞬时表达率; 剩余的小叶转入筛选培养基, 培养2周后对愈伤组织进行GUS表达检测, 统计抗性愈伤组织的诱导率。每个处理设3组重复, 试验重复2次。

由表3可知, Cef对根癌农杆菌具有显著的抑制作用。从菌落生长情况看, 100 mg·L-1 Cef即可完全抑制农杆菌的生长, 且对愈伤组织诱导率和再生率无显著影响。从愈伤组织和不定芽的诱导效率看, 随着Cef浓度的增加, 万寿菊小叶的愈伤组织诱导率和再生率逐渐下降, 当Cef浓度增至300 mg·L-1时, 愈伤组织诱导率和再生率均显著下降, 分别降至65.00%和35.00%, 且小叶开始出现失绿黄化现象。综合考虑, Cef的有效抑菌浓度为100 mg·L-1。

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