月季红双喜花瓣变色的化学基础及比较转录组分析 植物学报    2022, 57 (5): 649-660.   DOI: 10.11983/CBB22049

表3 月季红双喜不同呈色花瓣中mRNA、miRNA和LncRNA的数量

正文中引用本图/表的段落

通过荧光定量(qRT-PCR)方法对相关基因在不同发育时期的花瓣进行表达特性分析, 以验证转录组数据的可靠性。样品总RNA提取采用宝生物RNAiso Plus 试剂盒, 并用超微量分光光度计(NanoDrop 2000c)对RNA进行定量。反转录试剂盒采用宝生物Prime- Script? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit。荧光定量PCR试剂盒采用宝生物SYBR? Premix Ex Taq?。荧光定量PCR实验仪器为Bio-Rad CFX。以月季GAPDH基因作为内参(Klie and Debener, 2011), 采用2?ΔΔCT方法计算不同基因的相对表达量, 每个基因设3次重复, 数据分析用SPSS软件。荧光定量PCR所用引物见表1。

对红双喜不同呈色花瓣中的转录组进行分析(表3), 共鉴定出mRNA转录本36 193个。其中差异mRNA转录本(也称差异基因)为2 250个(上调1 371个, 下调879个); miRNA转录本为7 845个, 其中差异转录本22个(上调21个, 下调1个); LncRNA转录本为146 605个, 其中差异转录本51个(上调24个, 下调27个)。

编码基因的表达差异是性状差异化的分子基础。对红双喜不同呈色花瓣编码RNA (mRNA)的表达特性进行比较分析, 其中16 857个基因无差异表达, 差异表达基因有2 250个, 上调基因1 371个、下调879个(图3A)。将差异基因进行KEGG代谢通路富集分析, 结果表明, 有3个基因参与花青素苷合成(anthocyanin biosynthesis), 14个基因参与类胡萝卜素合成(carotenoid biosynthesis), 53个基因与光信号转导过程相关(photosynthesis和photosynthesis-antenna proteins) (图3B)。

花色是观赏植物的重要性状, 直接影响其观赏品质。决定花瓣呈色的化学物质有类黄酮/花青素苷、类胡萝卜素以及甜菜色素。其中, 类黄酮/花青素苷是分布最广泛的色素, 决定大多数植物的花瓣由黄色(黄铜和黄酮醇等)至紫色(花青素苷)的一系列呈色(Tanaka and Ohmiya, 2008; 朱满兰等, 2012); 类胡萝卜素则对百合(Lilium hybrida)和万寿菊(Tagetes erecta)等植物花瓣的呈色起决定性作用(Moehs et al., 2001; Yamagishi, 2011)。类黄酮的生物合成前体物质是苯丙氨酸, 其合成过程由一系列结构基因参与, 合成途径中一些关键基因的成员数量、序列特性以及表达方式是类黄酮成分差异的分子基础(Grotewold, 2006; Provenzano et al., 2014)。例如, F3′H是矢车菊色素合成的关键基因, F3′5′H主要决定飞燕草色素的合成; DFR和ANS是花青素苷合成的主效基因, FLS主要与ANS竞争决定黄酮醇的合成(Tanaka and Ohmiya, 2008; Sasaki and Nakayama, 2015); 糖苷化修饰基因则起稳定花青素苷结构的作用。本研究对月季红双喜花瓣的转录组数据分析表明, 花青素苷合成途径中的主效基因ANS及与花青素糖苷化修饰相关的3个UFGT基因在红色花瓣中的表达明显较强; 相应的红色花瓣中糖苷化修饰的花青素苷积累明显较多。天竺葵素和矢车菊素分别由F3H和F3′H基因决定, 2种类型的花青素苷在红色花瓣中的积累均明显增强, 意味着ANS和UFGT对2种类型花青素苷的合成和修饰无明显偏好性。该结果说明, 花青素苷合成通路中的这些关键基因在红色花瓣中的表达增强对其呈色起决定作用。但是, 红色花瓣中含氧类胡萝卜素修饰相关的一些基因表达较强, 并且玉米黄质和叶黄素积累明显增多; 这些类胡萝卜素相关基因的表达及成分变化可能对红双喜红色花瓣呈色起助色作用。色素分层分析也证明, 花青素苷对红色花瓣起主效作用, 对黄色(黄绿)花瓣起决定作用的是脂溶性色素。圣草素查尔酮和芹菜素等上游类黄酮在黄色花瓣中积累较多, 说明黄酮类物质对黄色花瓣呈色起助色作用。

本文的其它图/表

• 表1 qRT-PCR所用引物
  
• 表2 月季红双喜不同呈色花瓣中主要类胡萝卜素的成分含量差异
  
• 图1 月季红双喜不同发育时期花瓣呈色表型(A)、不同呈色花瓣类型中的类黄酮差异(B)及主要差异成分(C)
  S1: 萼片初展期; S2: 花瓣透色期; S3: 花瓣初开期; S4: 花瓣盛开期
  
• 表4 月季红双喜不同呈色花瓣中差异表达基因的功能注释
  
• 图2 月季红双喜不同呈色花瓣中差异LncRNA靶基因聚类(A)及差异siRNA靶基因聚类(B)
  
• 图3 月季红双喜不同呈色花瓣中的基因转录特性(A)及差异表达基因KEGG聚类(B)
  FDR: 错误发现率
  
• 图4 月季红双喜花瓣中花青素苷及类胡萝卜素合成通路相关基因的表达特性分析
  蓝色至红色代表基因表达由弱至强(彩图见网站版本)。*代表差异显著基因。
  
• 图5 月季红双喜不同呈色花瓣中差异表达R2R3-MYB基因和类黄酮调控相关R2R3-MYB基因进化分析(A)及R2R3-MYB相关基因的表达热图(B)
  Y和R同表2。*代表与花青素苷合成调控相关的R2R3-MYB基因。
  
• 图6 qRT-PCR验证相关基因在月季红双喜花瓣不同发育时期的表达特性
  S1-S4同图1。*表示与S1时期相比差异显著。