月季红双喜花瓣变色的化学基础及比较转录组分析 植物学报    2022, 57 (5): 649-660.   DOI: 10.11983/CBB22049

表1 qRT-PCR所用引物

正文中引用本图/表的段落

类胡萝卜素的测试和分析: 称取50 mg混合样品, 用0.5 mL含0.01% BHT (g·mL-1)的正己烷/丙酮/乙醇混合液(1:1:1, v/v/v)萃取; 室温下涡旋20分钟后, 4°C下, 13 000 ×g离心5分钟, 取上清。将得到的提取液浓缩后, 用100 μL甲醇/甲基叔丁基醚混合液(1:1, v/v)复溶, 过0.22 μm滤膜后, 保存于棕色进样瓶中, 用于色谱质谱分析(liquid chromatography-tandem mass spectrometric, LC-MS/MS)。靶向测试包括类黄酮以及类胡萝卜素, 色谱质谱数据采集系统包括超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography, UPLC) (ExionLC? AD, https://sciex.com. cn/)和串联质谱(tandem mass spectrometry, MS/ MS)。配制类胡萝卜素标准品溶液, 获取各个浓度标准品的对应定量信号质谱峰强度数据; 以标准品浓度(concentration)为横坐标, 标准品峰面积(area)为纵坐标, 绘制不同物质标准曲线。将检测到的所有样本的积分峰面积值代入标准曲线线性方程进行计算(含量(μg·g-1)=c*V/1000/m, 其中c代表样本中积分峰面积代入标准曲线得到的浓度值(μg·mL-1), V代表复溶时所用溶液的体积(μL), m代表称取样本的质量(g)), 进一步代入公式计算, 最终得到实际样本中该物质的含量。测试数据采用Analyst 1.6.3软件处理。

通过荧光定量(qRT-PCR)方法对相关基因在不同发育时期的花瓣进行表达特性分析, 以验证转录组数据的可靠性。样品总RNA提取采用宝生物RNAiso Plus 试剂盒, 并用超微量分光光度计(NanoDrop 2000c)对RNA进行定量。反转录试剂盒采用宝生物Prime- Script? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit。荧光定量PCR试剂盒采用宝生物SYBR? Premix Ex Taq?。荧光定量PCR实验仪器为Bio-Rad CFX。以月季GAPDH基因作为内参(Klie and Debener, 2011), 采用2?ΔΔCT方法计算不同基因的相对表达量, 每个基因设3次重复, 数据分析用SPSS软件。荧光定量PCR所用引物见表1。

月季红双喜随着花瓣的发育, 花色逐渐由黄色变为红色。花瓣变色的趋势由外至内, 并且与萼片的开放程度有直接关系。萼片完全包住的花瓣颜色为黄色, 当萼片展开露出花瓣, 花瓣逐渐呈现红色。对不同发育阶段的红双喜花瓣色素成分在不同溶剂中的分层观察表明, 无论黄色还是红色花瓣都含有溶于下层二氯甲烷的黄绿色素成分, 为类胡萝卜素或叶绿素; 上层为溶于水的类黄酮, 并且颜色随着花瓣的开放, 逐渐由浅黄变为红色(图1A)。对不同时期同种类型呈色(黄色vs红色)花瓣进行混合, 分析其叶绿素a以及叶绿素b的含量, 显示黄色花瓣叶绿素a的含量为1.872 mg·g-1, 叶绿素b的含量为2.576 mg·g-1; 而红色花瓣叶绿素a的含量为1.698 mg·g-1, 叶绿素b的含量为2.076 mg·g-1。同时, 用靶向代谢组方法对2种类型花瓣中的类胡萝卜素和类黄酮进行测定分析。结果表明, 红双喜花瓣中含类胡萝卜素成分49种; 含量较高的α-胡萝卜素包括玉米黄质(zeaxanthin)、紫黄质(viola-xanthin)以及紫黄质-肉豆蔻酸酯-发酸酯(violaxant-hin-myristate-caprate); 含量较高的β-胡萝卜素种类主要是叶黄素(lutein)。在这些类胡萝卜素成分中, 出现差异变化的共有9种, 均是含氧类胡萝卜素类型(表2); 其中下调6种, 但是含量较低; 上调3种, 包含叶黄素和玉米黄质。红双喜花瓣中鉴定出类黄酮代谢物309种, 其中上调63种、下调37种。上调幅度较大的类黄酮物质主要为花青素苷, 包括天竺葵素-3-O-葡萄糖苷(pelargonidin-3-O-glucoside)、矢车菊素-3-O-半乳糖苷(cyanidin-3-O-galactoside)、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-glucoside)以及芍药素-3-O-阿拉伯糖苷(peonidin-3-O-arabinoside); 相应的下调幅度较大的主要是圣草素查尔酮(3,4,2',4',6'-pentahydroxychalcone)以及芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷(apige-nin-7-O-glucuronide)等上游类黄酮代谢物(图1B)。以上分析表明, 红双喜花瓣中, 黄色花瓣贡献的色素类型包括叶绿素、类胡萝卜素和类黄酮; 而红色花瓣贡献的主要是花青素苷, 类胡萝卜素和叶绿素对红色花瓣的色调也起部分作用。

S1-S4同图1。*表示与S1时期相比差异显著。

本文的其它图/表

• 表2 月季红双喜不同呈色花瓣中主要类胡萝卜素的成分含量差异
  
• 图1 月季红双喜不同发育时期花瓣呈色表型(A)、不同呈色花瓣类型中的类黄酮差异(B)及主要差异成分(C)
  S1: 萼片初展期; S2: 花瓣透色期; S3: 花瓣初开期; S4: 花瓣盛开期
  
• 表3 月季红双喜不同呈色花瓣中mRNA、miRNA和LncRNA的数量
  
• 表4 月季红双喜不同呈色花瓣中差异表达基因的功能注释
  
• 图2 月季红双喜不同呈色花瓣中差异LncRNA靶基因聚类(A)及差异siRNA靶基因聚类(B)
  
• 图3 月季红双喜不同呈色花瓣中的基因转录特性(A)及差异表达基因KEGG聚类(B)
  FDR: 错误发现率
  
• 图4 月季红双喜花瓣中花青素苷及类胡萝卜素合成通路相关基因的表达特性分析
  蓝色至红色代表基因表达由弱至强(彩图见网站版本)。*代表差异显著基因。
  
• 图5 月季红双喜不同呈色花瓣中差异表达R2R3-MYB基因和类黄酮调控相关R2R3-MYB基因进化分析(A)及R2R3-MYB相关基因的表达热图(B)
  Y和R同表2。*代表与花青素苷合成调控相关的R2R3-MYB基因。
  
• 图6 qRT-PCR验证相关基因在月季红双喜花瓣不同发育时期的表达特性
  S1-S4同图1。*表示与S1时期相比差异显著。