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樟叶越桔细胞悬浮培养条件的优化

李楚然, 付羚, 刘云, 杨晓琴, 朱国磊, 解思达, 马焕成, 赵平

植物学报 2022, 57 (2): 227-235. DOI: 10.11983/CBB21069

摘要（343）

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为了提高樟叶越桔(Vaccinium dunalianum)悬浮培养细胞的生物量, 以樟叶越桔叶片愈伤组织为试材, 通过单因素试验探究不同蔗糖浓度、培养基pH值、培养基体积、初始接种量和摇床转速对悬浮培养细胞生长的影响, 并根据响应面法Box-Behnken试验设计原理进行组合试验以优化培养条件。结果显示, 以改良WPM培养基为基础培养基, 樟叶越桔细胞悬浮培养的最优条件为40 g·L^-1蔗糖、培养基pH5.2、培养基体积45 mL、初始接种量2.64 g和摇床转速为149 r·min^-1, 其细胞生物量干重为0.184 4 g, 与理论预测值0.184 5 g较为接近, 且细胞的生长曲线呈S型。研究结果为樟叶越桔悬浮培养细胞次生代谢产物的生产调控奠定了技术基础。

Source	Sum of squares	Degree of freedom	Mean square	F-value	P-value
Model	0.0351	20	0.0018	11.1033	<0.0001**
A	0.0052	1	0.0052	32.6506	<0.0001**
B	1.58E-05	1	1.58E-05	0.0999	0.7545
C	0.0011	1	0.0011	6.9608	0.0141*
D	0.0019	1	0.0019	11.8855	0.0020**
E	0.0004	1	0.0004	2.7363	0.1106
AB	8.37E-05	1	8.37E-05	0.5295	0.4736
AC	0.0011	1	0.0011	6.7422	0.0155*
AD	0.0002	1	0.0002	1.784	0.2880
AE	3.66E-05	1	3.66E-05	0.2315	0.6346
BC	0.0002	1	0.0002	1.4517	0.2395
BD	0.0001	1	0.0001	0.9803	0.3316
BE	6.25E-06	1	6.25E-06	0.0395	0.8440
CD	0.0004	1	0.0004	2.3193	0.1403
CE	1E-08	1	1E-08	6.32E-05	0.9937
DE	2.07E-05	1	2.07E-05	0.1309	0.7205
A²	0.0110	1	0.0110	69.6601	<0.0001**
B²	0.0077	1	0.0077	48.9624	<0.0001**
C²	0.0049	1	0.0049	28.3590	<0.0001**
D²	0.0089	1	0.0089	56.9051	<0.0001**
E²	0.1539	1	0.1539	97.3289	<0.0001**
Lack of fit	0.0039	20	0.0002	0.0714	0.7925
Pure error	2.215E-06	5	4.43E-07
Cor total	0.0390	45

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表3 樟叶越桔悬浮培养细胞生物量方差分析结果

正文中引用本图/表的段落

运用Design-Expert V12.0.3.3对试验数据进行分析, 得到樟叶越桔悬浮培养细胞生物量的二次回归方程Y=0.181 5+0.018A+0.001B+0.008 4C+0.010 7D- 0.005 2E+0.006 4AB+0.016 3AC+0.006 8AD-0.003AE-0.007 6BC+0.006 2BD+0.001 2BE+0.010 1CD+0.000 1CE-0.002 3DE-0.035 5A2-0.029 7B2- 0.022 8C2-0.032 2D2-0.041 9E2。回归模型的方差分析结果见表3。由表3可知, 模型的P值小于0.000 1, 回归效果极显著, 说明该模型可用于分析樟叶越桔细胞悬浮培养条件。R2=0.900 0表明90%生物量的变化受蔗糖浓度、培养基pH值、培养基体积、初始接种量和摇床转速5个因素的影响。5个因素中蔗糖浓度和初始接种量对生物量积累的影响极显著(P<0.01), 而培养基体积的P值小于0.05, 说明其对生物量的影响显著, 交互项中仅蔗糖浓度和培养基体积二者的交互作用为显著项(P_AC<0.05), 其余项对生物量累计的影响均不显著。P值和F值的大小可表示不同因素对生物量积累的影响程度, 单因素对生物量积累的影响大小依次是蔗糖浓度(A)>初始接种量(D)>培养基体积(C)>摇床转速(E)>培养基pH值(B)。

运用Design-Expert V12.0.3.3软件对各因素交互作用进行分析, 并绘制樟叶越桔悬浮培养条件的两因素响应面3D图(图2)。响应面曲面的陡峭程度可反映出两因素交互作用对生物量积累的影响程度, 曲面越陡峭说明两因素的交互作用对樟叶越桔悬浮培养细胞生物量的影响越大; 相反, 曲面越平缓则说明两因素的交互作用对生物量的影响越小。从图2A-J可知, 两因素响应面的曲面陡峭程度依次是AC>CD> BC>AD>BD>AB>AE>DE>BE>CE, 即蔗糖浓度和培养基体积两因素的交互作用对生物量的影响最大, 培养基体积和摇床转速的交互作用对生物量的影响最小, 这一结果也与表3的方差分析结果相符。

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