植物学报 ›› 2020, Vol. 55 ›› Issue (1): 9-20.doi: 10.11983/CBB19133

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转昆虫抗冻蛋白基因增强甘薯抗冻能力

赖先军1,张义正2,古英洪2,颜朗1,*()   

  1. 1西昌学院农业科学学院, 四川马铃薯高等学校重点实验室, 凉山 615013
    2四川大学生命科学学院, 四川省分子生物学及生物技术重点实验室, 成都 610064
  • 收稿日期:2019-07-05 接受日期:2019-09-24 出版日期:2020-01-01 发布日期:2019-12-20
  • 通讯作者: 颜朗 E-mail:langyan0807@hotmail.com
  • 基金资助:
    国家科技支撑计划(2007BAD78B03);四川省“十一五”重点科技攻关项目(No.07SG111-003-1)

Transformation of Insect Derived Antifreeze Gene into Sweet Potato (Ipomoea batatas) and Enhanced Its Freeze-tolerance

Lai Xianjun1,Zhang Yizheng2,Gu Yinghong2,Yan Lang1,*()   

  1. 1Sichuan Key Laboratory of Potatoes, College of Agriculture Science, Xichang College, Liangshan 615013, China
    2Sichuan Key Laboratory of Molecular Biology & Biotechnology, College of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610064, China
  • Received:2019-07-05 Accepted:2019-09-24 Online:2020-01-01 Published:2019-12-20
  • Contact: Yan Lang E-mail:langyan0807@hotmail.com

摘要:

为明确昆虫抗冻蛋白基因转入甘薯(Ipomoea batatas)后是否能提升其抗冻能力, 进而为培育甘薯抗冻育种材料奠定基础, 将黄粉虫(Tenebrio molitor)抗冻蛋白基因TmAFP导入植物基因表达质粒, 经农杆菌介导的遗传转化获得抗冻甘薯新材料。以甘薯品种Huachano为受体材料建立甘薯植株高效再生体系, 并采用不同成分的体细胞胚成熟培养基培养胚性悬浮细胞。胚性愈伤组织对除草剂的敏感性测试结果表明, 转基因阳性植株筛选的最适培养基为MS+0.2 mg·L -12,4-D+0.8 mg·L -1GAP+100 mg·L -1Carb。将表达质粒分别转化Huachano后共获得7个胚性愈伤团并最终获得42株再生抗性植株, 其中转pSUIBEV3-AFP有23个株系, 转pCAMBIA-AFP有19个株系, 经PCR、Southern杂交和RT-PCR检测后证实TmAFP基因已整合至甘薯基因组中并获得表达。将转基因甘薯及对照植株在-1°C下处理15小时后转移至室温, 结果表明, 转基因甘薯植株的抗冻能力显著提升。

关键词: 甘薯, 抗冻蛋白, 转基因, 甘薯植株再生, 分子育种

Abstract:

To explore whether the gene encoding antifreeze protein from insect can enhance the freezing tolerance of sweet potato through gene transformation, and to prepare freeze-tolerance materials for breeding purposes, we constructed a plant gene expression vector harboring an antifreeze gene TmAFP from yellow mealworms (Tenebrio molitor) and obtained transgenic freeze-tolerance sweet potato lines using Agrobacterium-mediated transformation method. A high-frequency regeneration system of sweet potato was established using the variety Huachano as the recipient material, and the embryogenic suspension cells were cultured in the somatic embryo maturation medium. The sensitivity test of embryogenic cells to herbicides indicated that the combination of MS+0.2 mg·L -12,4-D+0.8 mg·L -1GAP+100 mg·L -1Carb is the most effective medium for screening the transgenic positive plants. Seven embryogenic calli were obtained and 42 resistant seedlings were regenerated, among which 23 harbored pSUIBEV3-AFP and 19 had pCAMBIA-AFP. All resistant seedlings were examined by PCR, Southern hybridization and RT-PCR, and the results showed that the TmAFP gene was integrated into the plant genome and expressed. The transgenic and non-transgenic plants were treated at -1°C for 15 hours, and then transferred to room temperature. The results demonstrated that the freeze-tolerance of the transgenic plants was greatly improved.

Key words: sweet potato, antifreeze protein, transgenic, plant regeneration of sweet potato, molecular breeding

图1

甘薯遗传转化体系 (A), (B) 分别在MS+0.2 mg·L-1 2,4-D液体培养基中继代18和22周后的甘薯胚性悬浮细胞; (C) 在MS+0.2 mg·L-1 2,4-D固体培养基上培养8周后的甘薯胚性悬浮细胞; (D) 甘薯体细胞胚再生的小植株。(A), (B), (D) Bars=1 cm; (C) Bar=4 cm"

表1

不同体细胞胚成熟培养基对甘薯芽苗再生的影响"

Treatment Components
(mg·L-1)
Number of seedlings in average * **
1 MS 44.8±5.22 a A
2 MS+ABA1.0 33.6±5.18 b AB
3 MS+GA31.0 30.2±4.73 bc B
4 MS+ABA1.0+GA31.0 23.2±6.29 c B
5 MS+ABA4.0+GA31.0 21.8±6.58 c B

图2

不同浓度除草剂和抗生素对甘薯胚性愈伤组织和组培苗的影响 (A) 选择培养基上培养8周的甘薯胚性悬浮细胞。从左到右培养基依次为MS+0.2 mg·L-1 2,4-D分别添加0、0.2、0.4、0.6和0.8 mg·L-1 GAP; (B) 培养6周(从左至右第1, 2)和8周(3, 4)的胚性悬浮细胞, 培养基分别为MS+0.2 mg·L-1 2,4-D (1, 3)和MS+0.2 mg·L-1 2,4-D+100 mg·L-1 Carb (2, 4); (C) 培养8周的胚性悬浮细胞, 培养基为MS+0.2 mg·L-1 2,4-D+100 mg·L-1 Carb分别添加0.8、1.0、1.2和1.4 mg·L-1 GAP; (D) 分别为MS+0.2 mg·L-1 2,4-D+0.8 mg·L-1 GAP+100 mg·L-1 Carb培养基上接种0天和培养3周的Huachano茎尖。(A), (B), (C) Bars=1 cm; (D) Bar=2 cm"

图3

甘薯抗性体胚及其转基因植株再生过程 (A) 用于转化的甘薯胚性悬浮细胞在MS+0.2 mg·L-1 2,4-D液体培养基中28°C黑暗振荡培养32周; (B) 选择与非选择培养4周的胚性愈伤组织, a-c为选择性培养基(MS+0.2 mg·L-1 2,4-D+100 mg·L-1 Carb+0.8 mg·L-1 GAP), 箭头所指为抗性愈伤组织; d为未加除草剂的对照; (C) 转基因植株再生过程, a: 再生组织; b: 生芽; c: 生叶; d: 成株; e: 成苗。Bars=1 cm"

图4

TmAFP转基因甘薯植株的鉴定 (A) 采用除草剂(1.0 mg·L-1 GAP)对再生植株进行筛选(4-12、4-11、4-10、4-9: 抗性植株; 47-1、47-2: 非抗性植株; CK: 非转基因对照); (B) PCR快速鉴定转基因植株(AFP片段长度353 bp) (M: D2000 DNA marker (下同); +CK: pSUIBEV3-AFP质粒正对照; -CK: 未转化对照植株; 4-9、4-10、4-12: GAP抗性植株; 47-2: 非抗性植株); (C) 转基因植株的PCR检测(+CK: pSUIBEV3-AFP质粒作正对照扩增AFP基因; -CK: 未转化对照植株扩增AFP基因; 4-9-AFP: 转基因植株扩增AFP基因; 4-9-RPB2: 转基因植株扩增RPB2基因; -CK-RPB2: 未转化对照植株扩增RPB2基因); (D) Southern杂交(+CK: pCAMBIA-AFP质粒正对照; -CK: 未转化对照植株; 其余为不同转基因株系); (E) 转基因植株RT-PCR检测(RP1、RP2: 转pCAMBIA空载植株; 4-12、4-11、44-1、54-5: 转pCAMBIA-AFP株系)。"

图5

TmAFP转基因甘薯植株抗冻能力的检测 (A) 不同冷处理条件下植株电导率变化(CK1: 非转基因对照; CK2-4: 转空载的非抗冻植株; 4-9、4-10、4-11、4-12、44-1和54-5: TmAFP转基因株系; ** 表示差异极显著(P<0.01)); (B) -1°C条件下处理15小时后转移至室温条件, 转基因甘薯植株及对照的表型变化(Overall: 盆中同时栽种CK1、4-9、4-10、4-11、4-12; Non-transgenic: CK1放大图; Transgenic: 转基因株系4-9放大图)。Bars=5 cm"

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