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大花三色堇再生体系建立

张汝鑫, 李晨荣, 王童欣, 黎洁, 李霆格, 许慧娴, 李梅儿, 赵莹, 彭婷, 王健

植物学报 2025, 60 (6): 968-977. DOI: 10.11983/CBB24164

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为建立大花三色堇(Viola × wittrockiana)植株再生体系, 以其8个品种的叶片和叶柄为实验材料, 筛选并确定了再生率高的品种和部位。结果表明, PXP是供试品种中用于大花三色堇再生体系建立的最佳品种, 其叶柄是最佳外植体。以品种PXP的叶柄为外植体, 进行再生体系优化。结果表明, 愈伤组织诱导最适培养基为1/2MS (不含糖)+30 g∙L^-1蔗糖+1.5 mg∙L^-12,4-D+1.5 mg∙L^-1 KT, 不定芽诱导最优培养基为1/2MS (不含糖)+30 g∙L^-1海藻糖+0.05 mg∙L^-12,4-D+3 mg∙L^-16-BA, 再生苗经多次诱导分化, 再生率可达(67.33±3.06)%。不定芽增殖最优培养基为MS (不含糖)+30 g∙L^-1海藻糖+0.5 mg∙L^-12,4-D+1 mg∙L^-16-BA, 增殖系数为3.29±0.22。再生苗在配方为1/2MS (不含糖)+30 g∙L^-1海藻糖+0.1 mg∙L^-1NAA的生根培养基上培养2周后开始生根, 生根率为(84.44±6.93)%。该研究建立了分化率较高的大花三色堇再生体系, 解决了大花三色堇不定芽分化困难的难题, 为其育种改良和优良品种快繁提供了技术支持。

Type	6-BA (mg∙L^-1)	2,4-D (mg∙L^-1)	Number of explants	Proliferation coefficient	Growth situation
Z1	0.5	0.5	45	2.20±0.20 c	++
Z2	1.0	0.5	45	3.29±0.22 a
Z3	2.0	0.5	45	2.73±0.23 b	++
Z4	3.0	0.5	45	2.18±0.17 c	+

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表4 植物生长调节剂对大花三色堇不定芽增殖的影响

正文中引用本图/表的段落

以Y2培养基诱导的PXP叶柄愈伤组织为实验材料, 进行分化培养基优化。结果表明, 4号实验组愈伤组织分化率(26.67%)最高, 1号和3号实验组愈伤组织分化率(8.33%)最低(表3)。依据均值大小可判断不同水平处理对分化率的影响。通过计算得出KA2>KA3> KA1、KB2>KB1>KB3、KC3>KC2=KC1, 经判断得出A2为A因素的最优水平, B2为B因素的最优水平, C3为C因素的最优水平, 综合判断A2B2C3为最优水平组合。当以PXP叶柄为外植体时, 最佳分化培养基为1/2MS (不含糖)+30 g?L-1海藻糖+0.01 mg?L-1 2,4-D+3 mg?L-1 6-BA。通过计算极差(R)可得出3因素对分化率的影响主次顺序为A>C>B, 即影响分化率的因素从大到小依次为糖源种类、6-BA浓度和2,4-D浓度。方差分析表明, 糖源种类对分化率的影响具有显著的统计学意义, P值为0.017 (P<0.05), 表明糖源种类对实验结果有显著影响。相比之下, 2,4-D浓度和6-BA浓度的P值分别为0.25和0.2, 说明这2个因素在本实验条件下对结果无显著影响。综上所述, 糖源种类显著影响愈伤组织分化。添加不同种类糖源导致分化率差异显著, 而6-BA浓度和2,4-D浓度对愈伤组织分化影响不显著。取生长状态基本一致的愈伤组织接种于A2B2C3培养基上并验证分化效果, 结果分化率为(27.33±3.06)%, 优于各正交试验处理组, 说明A2B2C3为最适分化培养基。

将诱导的不定芽转移至增殖培养基进行增殖培养。10天后, 愈伤组织块上开始出现新的不定芽, 部分愈伤组织块可分化出4个及以上不定芽。30天后, 不同处理间增殖系数存在显著差异。结果显示, 随着6-BA浓度的增高, 增殖系数呈先升高后下降趋势。用于大花三色堇不定芽增殖培养的6-BA最适浓度为1.0 mg?L-1。在Z2培养基中增殖系数最高, 为3.29±0.22 (表4), 该实验组的不定芽呈鲜绿色且高度最大, 丛生芽紧凑, 生长状态最好。

糖类物质在植物组织培养中兼具营养和调控作用, 使用浓度一般为30 g?L-1 (Encina et al., 2014)。构建再生体系时, 在基础培养基中添加蔗糖对培养物的生长速率、代谢水平及次生代谢物合成有显著效果(丁世萍, 1998; Ameri et al., 2020)。也有研究发现, 麦芽糖和海藻糖在组织培养中发挥关键作用。20 g?L-1海藻糖可促进文心兰(Oncidium hybridum)类圆球茎的形成和发育, 添加麦芽糖也能达到类似效果(Jheng et al., 2006; 李雪青等, 2020)。麦芽糖更适合枣(Ziziphus jujuba)愈伤组织的诱导和增值(张梦玲, 2021)。本研究发现, 蔗糖和麦芽糖均不适合大花三色堇的不定芽分化, 30 g?L-1海藻糖适合大花三色堇的分化培养, 因此确定最佳分化培养基为1/2MS (不含糖)+30 g?L-1海藻糖+0.05 mg?L-1 2,4-D+3 mg?L-1 6-BA (表3)。在Z2培养基上不定芽增殖效率最高, 增殖系数为3.29±0.22 (表4)。随着6-BA浓度的增加, 不定芽的增殖系数先增高后降低。在不定芽增殖实验中, 当6-BA浓度为3 mg?L-1时, 芽点数量最多。然而, 这些芽点无法成功分化出不定芽, 且出现玻璃化、丛生芽矮小的现象。在后续继代增殖中, 可考虑逐步降低6-BA浓度, 用高浓度6-BA增加芽点, 低浓度6-BA促使芽点正常发育, 以实现不定芽增殖最大化。

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