植物缺铁诱导型香豆素合成及其在铁吸收中的功能研究进展 植物学报    2025, 60 (3): 460-471.   DOI: 10.11983/CBB24106

表1 缺铁诱导型香豆素类化合物合成与调控相关基因

正文中引用本图/表的段落

在植物漫长的进化过程中, 为适应不同的低铁环境, 植物进化出不同的铁吸收机制。Ro?mheld和Mar-schner (1986)首次将植物铁吸收机制分为机理I和机理II。机理I植物主要包括双子叶和非禾本科单子叶植物, 采用还原机制(reduction-based strategy)。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中, 该机制主要包括3个步骤。首先, 植物通过根表皮细胞上的H+-ATPase泵系统(AHA2), 分泌H+降低根际环境的pH, 促进铁的溶解; 其次, 根表皮细胞质膜表面的铁氧化还原酶FRO2 (ferric reduction oxidase 2)将Fe3+还原成Fe2+; 最后, Fe2+通过质膜表面高亲和性的铁转运蛋白IRT1 (iron-regulated transporter 1)吸收进入细胞质(Gao and Dubos, 2021)。机理II植物主要包括禾本科植物, 采用螯合机制(chelation-based strategy)。水稻(Ory- za sativa)合成分泌麦根酸(mugineic acid, MA)家族的铁载体(phytosiderophores, PS)到根际土壤中, 直接与土壤中的Fe3+结合形成螯合物, 然后通过YSL家族转运蛋白(YELLOW STRIPE1-like)吸收至胞内, 再释放出Fe3+供植物体利用(Gao et al., 2020a, 2020b; Gao and Dubos, 2021)。

香豆素类化合物是一类以苯并吡喃酮为母环结构的酚类化合物, 来源于植物苯丙烷代谢途径(Waters et al., 2018)。苯丙烷代谢是最重要的植物次生代谢途径之一, 产生超过8 000种代谢物, 对植物生长发育及植物-环境互作有重要影响(Dong and Lin, 2021)。苯丙烷代谢途径中的木质素和黄酮等代谢通路已得到广泛研究, 然而直到近年, 缺铁诱导型简单香豆素的生物合成途径才得以初步解析(Robe et al., 2021b) (图1)。蛋白质组分析表明, 多个苯丙烷代谢途径关键酶在蛋白水平上响应缺铁处理(Lan et al., 2011; Pan et al., 2015)。其中包括苯丙烷代谢途径的第1个关键酶苯丙氨酸解氨酶PAL1 (phenylalanine ammonia-lyase1), 以及合成苯丙烷代谢途径的重要分支前体4-香豆酸辅酶A (4-coumaroyl-CoA)的关键酶4CL (4-coumarate:CoA ligases)。此外, 合成香豆素前体阿魏酰辅酶A (feruloyl-CoA)的关键酶羟基肉桂酰辅酶A莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransferase, HCT)和咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶1(caffeoyl-CoA O-methyltransferase 1, CCoAOMT1)在蛋白水平上也响应缺铁处理(Lan et al., 2011; Pan et al., 2015) (表1)。在转录水平上, 缺铁和富铁处理之间差异基因的共表达分析表明, PAL1、PAL2、4CL1、4CL2和C4H (Cinnamate-4-hydroxylase)等香豆素前体合成相关的关键酶基因响应缺铁处理(Yang et al., 2010; Rodríguez-Celma et al., 2013; Fourcroy et al., 2014) (表1)。综上所述, 香豆素前体合成相关的关键酶基因在转录水平和蛋白水平上响应缺铁处理, 从而促进香豆素前体合成, 为进一步合成下游的香豆素类化合物奠定基础。

研究表明, 拟南芥根部可以合成并分泌具有铁活化能力的简单香豆素类化合物, 包括秦皮素fraxetin和sideretin和秦皮乙素esculetin (Rajniak et al., 2018)。首先, 香豆素前体阿魏酰辅酶A (feruloyl-CoA)在阿魏酰辅酶A 6′-羟化酶(feruloyl-CoA 6′-hydroxylase 1, F6′H1)的催化下生成6′-羟基阿魏酰辅酶A (6′-hydroxyferuloyl-CoA) (Kai et al., 2008; Schmid et al., 2014) (图1)。F6′H1是开启香豆素代谢通路的第1个关键酶, 编码F6′H1的基因功能缺失影响下游香豆素的合成。相比野生型拟南芥, f6′h1突变体在高pH或者低铁条件下生长受抑制, 呈现幼叶脉间黄化等典型的缺铁症状(Schmid et al., 2014)。进一步研究发现, 外源施加香豆素类化合物可以恢复f6′h1突变体的缺陷表型, 表明香豆素类化合物在铁吸收中具有重要作用(Schmid et al., 2014)。莨菪亭scopoletin是拟南芥中最主要的香豆素类化合物之一, 由6′-羟基阿魏酰辅酶A通过反式-顺式异构化和内酯化生成, 该反应步骤在某种程度上可以在光催化下自发进行。Vanholme等(2019)研究表明, BHAD酰基转移酶家族的香豆素合成酶(coumarin synthase, COSY)可以提高该步骤的反应效率, 并且在植物根部等无光照条件下促进莨菪亭的生物合成(Vanholme et al., 2019) (图1)。莨菪亭scopoletin是合成秦皮素fraxetin和sideretin的重要前体。莨菪亭scopoletin在莨菪亭8-羟化酶(scopoletin 8-hydroxylase, S8H)的催化下生成秦皮素(fraxetin) (Siwinska et al., 2018; Tsai et al., 2018), fraxetin进一步在细胞色素P450家族酶CYP82C4的催化下生成sideretin (图1)。然而, 关于秦皮乙素esculetin的生物合成仍有争议。Vanholme等(2019)发现香豆素合酶COSY可以在体外催化6′-hydroxycaffeoyl-CoA合成秦皮乙素esculetin, 但是该催化步骤未在植物体内得到证实。此外, Rajniak等(2018)研究发现, 在烟草(Nicotiana tabacum)中瞬时表达F6'H1基因可以诱导秦皮乙素esculetin的合成, 推测秦皮乙素esculetin可能通过莨菪亭scopoletin去甲基化合成, 其反应合成步骤有待进一步研究。COSY、S8H和CYP82C4在转录水平上受缺铁和高pH诱导(表1), 且其基因缺失突变体相比野生型表现出对缺铁和高pH更敏感, 进一步证实这些基因参与合成的下游香豆素类化合物秦皮素fraxetin和sideretin在植物响应缺铁反应中具有重要功能(Murgia et al., 2011; Rajniak et al., 2018; Siwinska et al., 2018; Tsai et al., 2018; Vanholme et al., 2019)。

铁缺乏诱导拟南芥莨菪亭scopoletin、秦皮素fraxetin、秦皮乙素esculetin和sideretin等主要香豆素类化合物的合成(Robe et al., 2021b)。与其它酚类化合物类似, 香豆素类化合物不稳定且具有一定的细胞毒性, 因此通常被进一步糖基化形成香豆素糖苷(莨菪苷scopolin、秦皮苷fraxin、秦皮甲素esculin和sideretin糖苷), 并储存于液泡中(Werner and Matile, 1985; Knoblauch et al., 2015; de Brito Francisco and Martinoia, 2018)。然而, 研究表明植物根分泌物中的香豆素类化合物大部分以非糖苷形式存在, 因此在香豆素类化合物分泌前需要进行去糖基化反应(Ziegler et al., 2017; Lefèvre et al., 2018)。拟南芥中, 根部生毛细胞(trichoblast)特异性表达的β-葡萄糖苷酶BGLU42 (beta glucosidase 42)负责莨菪苷scopolin的去糖基化(Zamioudis et al., 2014) (表1)。bglu42突变体能够积累更多香豆素类化合物, 但是只有极少的香豆素类化合物被分泌到根际环境中, 说明BGLU42的去糖基化作用为香豆素类化合物分泌前加工所必需(Zamioudis et al., 2014)。Ahn等(2010)鉴定发现3个拟南芥根部表达的β-葡萄糖苷酶BGLU21、BGLU22和BGLU23在体外具有类似BGLU42的活性, 可以水解莨菪苷scopolin和秦皮甲素esculin生成其对应的苷元。尽管如此, 仍然需要通过体内实验进一步证实BGLU21、BGLU22和BGLU23的生物学功能。因此, 参与秦皮苷fraxin、秦皮甲素esculin和sideretin糖苷分泌前去糖基化的酶仍有待进一步挖掘鉴定。

近年来, 两项独立的研究显示香豆素类化合物的分泌主要依赖于ABCG37/PDR9转运蛋白(Rodríguez-Celma et al., 2013; Fourcroy et al., 2014) (表1)。Rodríguez-Celma等(2013)报道, 与野生型拟南芥相比, pdr9突变体无法从低生物利用度铁源中吸收铁。此外, pdr9突变体在低铁或高pH条件下表现出更明显的缺铁表型(Rodríguez-Celma et al., 2013; Fourcroy et al., 2014)。进一步研究显示, 相比野生型拟南芥, pdr9突变体无论在富铁还是缺铁条件下根部均能够积累更多的莨菪亭scopoletin及其衍生物, 而在根际分泌物中相关香豆素类化合物的含量显著降低, 证实PDR9在香豆素类化合物的分泌中具有重要功能 (Rodríguez-Celma et al., 2013; Fourcroy et al., 2014)。同时, pdr9突变体根际分泌物中微量香豆素类化合物的存在也表明其它转运蛋白可能参与香豆素类化合物的分泌。此外, 在烟草中PDR9的同源基因NtPDR3在转录水平上响应缺铁, 参与O-甲基化香豆素的分泌, 表明这种转运蛋白的功能在不同物种之间具有保守性(Ducos et al., 2005; Lefèvre et al., 2018)。直到最近, 根表皮细胞中的生毛细胞和非生毛细胞(atrichoblast)是否对不同香豆素类化合物的分泌具有特异性仍是一个开放性问题。Robe等(2021a)采用光谱成像技术在不同根毛突变体中分析了不同香豆素类化合物含量, 结果显示根毛在莨菪亭scopoletin的分泌中具有重要作用, 而秦皮素fraxetin和秦皮乙素esculetin的分泌不依赖于根毛, 可发生在所有根表皮细胞中。值得注意的是, 有研究在植物根际(尤其是在缺铁条件下)发现了少量的糖基化香豆素(Ziegler et al., 2017; Lefèvre et al., 2018; Stringlis et al., 2018)。上述研究表明, 一部分糖基化香豆素可以直接通过未知机制分泌到根际环境, 或者香豆素类化合物苷元可以在植物根际被糖基化, 相关机制有待进一步研究(Ziegler et al., 2017; Stringlis et al., 2018)。

虽然已知香豆素的生物合成受缺铁、缺磷和重金属等因素影响, 然而对其所涉及的调控机制却知之甚少(Schmid et al., 2014; Tsai et al., 2018; Chutia et al., 2019)。研究表明, 拟南芥中有17个bHLH家族转录因子参与调控植物铁吸收(Gao et al., 2019; Gao and Dubos, 2021)。其中, FIT是一个IIIa亚家族的bHLH转录因子, 其通过与不同的蛋白质相互作用调控铁吸收相关基因(IRT1和FRO2等)的表达, 在拟南芥铁吸收调控中起核心作用(Colangelo and Guerinot, 2004; Bauer et al., 2007; Schwarz and Bauer, 2020)。Colangelo和Guerinot (2004)通过转录组分析, 发现香豆素类化合物合成相关基因F6′H1、S8H和CYP82C4在fit-1突变体中表达显著下调。与fit-1突变体中香豆素合成相关基因表达下调一致, fit-1突变体中fraxin和sideretin糖苷含量相比野生型拟南芥显著降低(Schmid et al., 2014; Chutia et al., 2019)。因此, FIT是拟南芥中香豆素合成的重要调节因子之一, 然而关于FIT是直接或者间接调控F6′H1、S8H和CYP82C4基因的表达量仍然未知(图2)。MYB72是FIT依赖型转录因子, 在转录水平上受FIT转录因子调控(Colangelo and Guerinot, 2004) (图2)。Stringlis等(2018)研究发现, myb72突变体及其根际分泌物中的scopoletin和esculetin等香豆素类化合物显著降低。Zamioudis等(2014)研究表明, 过量表达MYB72可以激活上游苯丙烷代谢途径关键酶基因PAL、C4H、4CL、HCT和CCoAOMT, 以及香豆素合成相关基因S8H, 而不影响F6′H1基因的表达(图2)。因此, 推测MYB72通过调控上游苯丙烷代谢途径关键酶, 控制香豆素类化合物前体阿魏酰辅酶A的合成, 从而调控下游香豆素类化合物的合成(Zamioudis et al., 2014)。此外, MYB72可能通过调控S8H的表达调控下游fraxetin以及sideritin的合成(图2)。DeLoose等(2024)研究表明, MYB63可以通过调节COSY和F6′H1基因的表达调控香豆素的合成。Gao等(2020a)研究发现, bhlh121突变体中scopoletin、fraxetin和sideritin相比野生型拟南芥显著降低, 尤其是下游的fraxetin和sideritin。进一步分析表明, bhlh121突变体中F6′H1的表达在缺铁条件下轻度下调, 而S8H和CYP82C4的表达在缺铁和富铁条件下均显著下调, 表明bHLH121通过调控F6′H1、S8H和CYP82C4的表达调控香豆素类化合物的合成(图2), 他们采用ChIP- qPCR方法发现bHLH121不能直接结合F6′H1、S8H和CYP82C4基因的启动子序列, 推测bHLH121可能通过直接调控MYB72和FIT转录因子从而间接调控F6′H1、S8H和CYP82C4基因的表达(Gao et al., 2020a)。此外, 香豆素类化合物的合成还受到其它转录因子的调控。MYB15是参与防御诱导的木质素合成和基础免疫的关键转录因子, 可以激活PAL、C4H、4CL、HCT、CCoAOMT和F6′H1等基因的表达, 从而促进香豆素类化合物前体的合成(Chezem et al., 2017) (表1)。拟南芥中, 3个KFB蛋白(Kelch domain- containing F-box proteins)参与苯丙烷代谢途径关键酶蛋白的周转, 其中KFB1和KFB20受缺铁诱导, 推测它们参与香豆素合成通路的转录后调控(Zhang et al., 2013, 2015; Tsai and Schmidt, 2017) (表1)。

本文的其它图/表

• 图1 拟南芥缺铁诱导型香豆素类化合物生物合成途径
  PAL: 苯丙氨酸解氨酶; C4H: 肉桂酸-4-羟化酶; 4CL: 4-香豆酸:辅酶A连接酶; HCT: 羟基肉桂酰辅酶A莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶; C3′H: 4-香豆酰莽草酸/奎宁酸3′-羟化酶; CCoAOMT: 咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶; F6′H1: 阿魏酰辅酶A 6′-羟化酶; COSY: 香豆素合成酶; S8H: 莨菪亭8-羟化酶; CYP82C4: 细胞色素P450家族酶
  
• 图2 拟南芥缺铁诱导型香豆素类化合物合成调控
  PAL、C4H、4CL、HCT、C3′H、CCoAOMT1、F6′H1、COSY、S8H和CYP82C4同图1。IVc bHLH: 拟南芥IVc bHLH亚家族转录因子; Ib bHLH: 拟南芥Ib bHLH亚家族转录因子; FIT: 拟南芥bHLH29转录因子