植物抗冻蛋白研究进展
董小云, 魏家萍, 崔俊美, 武泽峰, 郑国强, 李辉, 王莹, 田海燕, 刘自刚
植物学报
2023, 58 ( 6):
966-981.
DOI: 10.11983/CBB22248
温度是决定植物地理分布的主要环境因子之一, 分布于高纬度、高海拔地区的寒地植物, 在其生活史周期内通常会遭遇一段时期的零度以下低温。当环境温度降至冰点以下, 植物体内水分子趋向于形成冰晶体, 不断增大的冰晶对植物组织结构造成致命损伤。为适应冷冻环境, 寒地植物病程相关蛋白(PR)及相关的WRKY转录因子进化成为能与冰面特异吸附结合、高效抑制冰晶形成和生长的抗冻蛋白(AFPs)。目前, 已从冬黑麦(Secale cereale)等近百种植物中分离鉴定了AFPs。与昆虫AFPs相比, 植物AFPs具有极高的重结晶抑制活性, 可有效防止形成体内大冰晶。低温和病原菌均可诱导寒地植物合成AFP。有趣的是, 仅冷诱导合成的AFPs有水解酶/抗冻活性双重分子功能。然而, 越来越多的证据表明, PR-AFP仅具有水解酶/抗冻活性的其中一种, 其转化由翻译后肽差异折叠控制/调节。AFP因具有独特的分子功能与广阔的应用前景而逐渐成为植物学领域的研究热点。该文对近年来相关领域取得的研究进展进行系统综述。
| 物种名称 | 材料 | AFPs的
亚细胞定位 | 分子量
(kDa) | 属性 | 同源蛋白 | 参考文献 | 欧白英
(Solanum dulcamara) | 茎 | 细胞膜和细
胞质 | 67 | 富含甘氨酸(23.7%),
TH=-0.3°C, >30 mg?mL-1,
高RI活性 | WRKY转录因子 | Duman, 1994 | 冬黑麦
(Secale cereale) | 叶 | 质外体 | 15-38 | 0.1 mg?mL-1, TH=0.03°C | 几丁质酶、葡聚
糖酶和类甜蛋白 | Hon et al., 1994, 1995 | 南极发草
(Deschampsia antarctica) | 叶 | 质外体 | 29 | 富含亮氨酸 | 磺肽素受体激酶 | John et al., 2009 | 白菜型冬油菜
(Brassica rapa) | 叶 | 细胞质和细
胞核 | 38 | - | β-1,3-葡聚糖酶 | Liu et al., 2019 | 胡萝卜
(Daucus carota) | 根 | 质外体 | 36 | 1 mg?mL-1时, TH=-0.35°C,
高RI活性 | 多聚半乳糖醛酸
酶抑制剂蛋白 | Worrall et al., 1998;
Meyer et al., 1999 | 沙冬青
(Ammopiptanthus
mongolicus) | 叶 | 细胞质 | 40 | 热稳定蛋白, 糖基化, 20 mg?mL-1时, TH=0.9°C | 凝集素 | 费云标等, 1994;
Yong et al., 2000 | 冬小麦
(Triticum aestivum) | 叶 | 质外体 | 21.3 | 热稳定蛋白, 富含β-折叠和无规则卷曲 | 类甜蛋白 | Chun et al., 1998;
Kontogiorgo, 2007 | 黑麦草
(Lolium perenne) | 叶 | 质外体 | 29 | 有RI活性 | - | Sidebottom et al., 2000;
Pudney et al., 2003 | 蓝叶云杉
(Picea pungens) | 叶 | 质外体 | 27 | 0.4 mg?mL-1时, TH=(2.02±
0.40)°C | 几丁质酶 | Jarzabek et al., 2009 | 无芒雀麦
(Bromus inermis) | 细胞培养 | 分泌物和质
外体 | 33 | 钙离子非依赖抗冻活性, 六角双锥体冰晶形态 | I型几丁质酶 | Nakamura et al., 2008 | 连翘
(Forsythia suspensa) | 树皮和叶 | 细胞质 | 20 | 热稳定蛋白, 高RI活性
(6 μg?mL-1) | 与脱水蛋白同源 | Simpson et al., 2005 | 蜡梅
(Chimonanthus praecox) | 花冠 | 质外体 | 33 | 1.5 mg?mL-1时, TH=0.52°C | I型几丁质酶 | Zhang et al., 2011 | 沙棘
(Hippophae rhamnoides) | 枝条 | 质外体 | 41 | 糖基化, 热不稳定蛋白,
TH=0.19°C, 9倍RI | 多聚半乳糖醛酸
酶抑制剂蛋白 | Gupta et al., 2012 | 萝卜
(Raphanus sativus) | 块茎和叶 | 质外体 | 1.32 | 块茎: TH=(0.2±0.03)°C;
叶: TH=(0.18±0.02)°C | - | Kawahara et al., 2009 | 欧洲云杉
(Picea abies) | 叶 | 质外体 | 27和70 | 0.4 mg?mL-1时,TH=(2.19±
0.83)°C | 几丁质酶 | Sabala et al., 1996;
Jarzabek et al., 2009 | 桃
(Prunus persica) | 树皮 | 细胞质、细胞
核和木质部薄壁细胞 | 60 | 热稳定蛋白, 28.3 μg?mL-1时, TH=0.06°C | 脱水蛋白 | Wisniewski et al., 1999 |
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表1
不同植物中抗冻蛋白(AFPs)的性质
正文中引用本图/表的段落
Griffith等(1992)首次从冬黑麦(Secale cereale)中分离纯化出具有抗冻活性的AFP, 此后研究者从几十种寒地植物或越冬植物中分离出抗冻蛋白, 包括蕨类植物、裸子植物和被子植物(Gong et al., 1996; Griffith and Yaish, 2004; Raymond et al., 2009)。分子演化分析表明, 不同类型的抗冻蛋白具有相似的分子功能, 但它们并非同源分子, 其多肽链中不含具有家族特征性的氨基酸残基保守序列。抗冻蛋白活性的结构基础在于三维空间上靠近的氨基酸残基构成亲冰结构域和疏水结构域, 分别负责分子与冰晶亲和吸附和扰乱晶格附近水分子位序, 使抗冻蛋白获得抑冰活性。与鱼类和昆虫等动物和菌类抗冻蛋白相比, 植物抗冻蛋白在分子功能方面有2个显著特征。一是植物抗冻蛋白虽然热滞活性(thermal hysteresis, TH)较低, 但有极高的重结晶抑制活性(recrystallization inhibition, RI) (Worral et al., 1998)。多数植物抗冻蛋白分子量较大, 其表面通常包含多个亲水性冰晶亲和结构域, 可结合和包裹多个晶核并高效阻止重结晶。二是多数植物具有抗冻活性和抗病抑菌(pathogenesis-related, PR)活性双重功能。PR-AFPs主要包括β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶、类甜蛋白和多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白等具有PR活性的抗冻蛋白(李文轲和马春森, 2012)。有趣的是, 病原菌诱导合成的这类蛋白仅有PR活性而无抗冻活性; 冷诱导合成的蛋白具有PR和AFP双重活性。在积雪层下等低温环境中, 植物物质代谢和能量代谢等生命活动趋于减缓甚至停滞; 然而, 植物根际土壤中病原菌比其寄主的活动温度更低, 病原微生物仍保持较高的代谢水平和侵染能力, 在长期的冷冻和病原菌侵染双重逆境压力下, 植物演化出PR-AFPs双重分子功能这种高效的应对策略。由于独特的分子功能以及在抗寒中发挥的重要作用, 植物抗冻蛋白成为植物抗寒研究的热点。本文综述了植物抗冻蛋白的分子结构与理化性质、低温诱导合成调控、AFPs-冰晶结合与抑冰机理等研究进展, 为深入理解植物抗冻机理和抗寒育种应用提供参考。
植物AFPs亲和吸附在冰晶表面, 可降低细胞溶液的冰点, 而其熔点几乎不变, 这种性质称为热滞活性(TH) (DeVries, 1986)。当环境温度低于冰点时, 溶液中开始形成细小晶核, AFPs能够阻止冰晶融合与生长, 防止形成大冰晶, 并修饰冰晶形态, 这种性质即为重结晶抑制活性(RI) (Knight and Duman, 1986)。目前, 已发现60多种植物在低温环境下积累抗冻活性物质, 我们对不同植物中抗冻蛋白的性质、来源及同源蛋白进行了总结(表1)。
植物AFPs具有极高的RI活性可能与其分子具有多个冰结合结构域有关。例如, 多年生黑麦草(Lolium perenne) LpAFP被预测折叠成1个具有2个冰结合结构域β-roll, 位于蛋白质的相对两侧(Kuiper et al., 2001)。在无AFPs存在时, 冰晶通常沿着a轴生长, 形成1个六边形晶格, 冰晶形态呈盘状, 单个晶格有基面和棱面2个不同的平面, 冰的生长是由于水分子结合到这些平面上。在有AFPs的溶液中, AFP可结合到冰晶棱面, 阻断水分子进入棱面晶格, 冰晶沿a轴生长完全被抑制, 少数水分子进入基面晶格, 使冰晶沿c轴生长, 由于AFPs浓度不同, 可形成双棱锥形和披针形等形态的冰晶(Griffith and Yaish, 2004; Scotter et al., 2006)。低温处理白菜型冬油菜(Brassica rapa)幼苗叶片质外体蛋白质提取液, -7°C放置50分钟, 形成数量众多的细小冰晶体, 冰晶形态多为米粒状(图1A); 而对照(常温处理)叶片质外体蛋白提取液形成的冰晶体积大, 数量较少, 存在多种形态的冰晶体, 其中以不规则形状为主, 此外还有较多尖长锥形、近椭圆形、梭形及棒状冰晶体(图1B)。从冰晶形态上, 常温处理的幼苗叶片提取液-7°C放置50分钟, 体积细小的晶核通过重结晶和晶体持续生长, 形成大冰晶体, 并未表现出重结晶抑制和形态修饰活性; 而低温处理的幼苗叶片提取液晶核未发生明显的重结晶现象, 表明低温处理后, 叶片中含有高活性AFP物质具有明显的晶核重结晶抑制活性(图1) (Liu et al., 2019)。在低温诱导下, 越冬植物通常合成几种AFPs, 每个AFP具有2个或以上冰结合结构域, 可吸附到冰晶体的不同表面, 不同结构域对冰晶表面的亲和力有差异, 多个结构域协同作用, 阻止水分子进入不同轴向的晶格中, 并不同程度地抑制冰晶各轴向生长(DeVries, 1986)。
植物AFPs的TH活性(0.1-0.5°C)明显低于冷水鱼类(Griffith and Yaish, 2004)。一般植物AFPs热滞活性在1°C以内, 桃(Prunus persica)的AFPs热滞活性较低, 为0.06°C (表1); 云杉(Picea asperata)的AFPs热滞活性较高, 在0.4 mg?mL-1时约为2.19°C (Jarzabek et al., 2009), 但比鱼类和昆虫AFPs的热滞活性低得多。多数越冬植物直接暴露在环境中, 其生存的陆地环境温度远低于海水温度。在漫长的严冬, 环境温度通常降至-30°C以下, 在极冷环境中, 仅依赖降低生物细胞内外溶液凝固点防止体内结冰是不可行的。在此种情形下, 植物改变了低温适应策略, 即较低的TH活性和较高的RI活性。遇冷时AFPs可强烈抑制冰晶重结晶, 这对于直接暴露在极冷环境中的植物是一种有效的抗冻策略。
TH和RI同表1。
TH和RI同表1. ... Antifreeze proteins from diverse organisms and their applications: an overview 1 2017 ... Middleton等(2012)研究了黑麦草LpAFP的晶体结构, 发现有1个β-roll结构域, 它含有2个保守的Asn残基和1个疏水内核, 起稳定结构域的作用.LpAFP的冰结合面(ice-binding surface, IBS)位于β-roll结构域的1个β片层上, LpAFP通过IBS与冰晶的基面和棱面吸附结合.胡萝卜DcAFP的IBS结构域中Asn残基负责连接到晶格中(Zhang et al., 2004).以LpAFP蛋白晶体结构为模型, 使用同源建模对47种植物AFP的三维结构进行预测, 成功构建了9种植物AFP蛋白的三维结构, 发现胡萝卜、欧白英和冬黑麦AFP蛋白的三维结构以β-折叠为主(Gupta and Deswal, 2014a).植物AFP的β片层结构在AFPs家族广泛存在, β片层结构是冷水鱼II型和III型、昆虫(Cheung et al., 2017)和微生物海洋单胞菌(Marinomonas primoryensis) (Garnham et al., 2008) AFPs的主要结构, 包含与冰晶结合的重要结构构件. ... Genetic studies of antifreeze proteins and their correlation with winter survival in wheat 1 1998 ... Properties of different plant antifreeze proteins (AFPs)
TH: 热滞活性; RI: 重结晶抑制活性 ... Psychrophilic lifestyles: mechanisms of adaptation and biotechnological tools 1 2019 ... AFPs-冰晶结合力的调节是AFPs抗冻机制的关键, 也是理解AFPs结构与功能的重点.早期研究表明, 氢键是AFPs与冰晶结合的作用力, AFPI亲水性残基Thr和Asp在二级螺旋上呈规律性间隔, Thr羟基与Asp羧基间的距离为4.5?, 这与冰晶平面上氧原子的间距正好匹配, 两者之间形成氢键, 从而使AFPs稳定结合冰面(DeVries, 1983).同时, AFPI存在螺旋轴亲水基团和疏水基团的偶极子, AFPI偶极子与冰晶周围水分子的偶极子相互作用, 两亲性的α-螺旋经亲水侧链定位, 提供与晶格相互作用的氢键, 而疏水侧链则阻止冰晶的生长.然而氢键数量和作用强度不足以保证AFPs-冰晶不可逆结合的稳定性(Collins and Margesin, 2019).Thr残基上的羟基可凸入冰晶晶格内部, 并占据晶格中氧原子的位置, 因而可以毫无障碍地与邻近晶格中的氧原子同时形成3个氢键, 并将 AFP有效地固定在晶格的顶层.糖侧链在结合冰晶中也发挥重要作用(Giubertoni et al., 2019). ... A low temperature induced apoplastic protein isolated from Arachis hypogaea 1 1998 ... 植物细胞通过冷信号通路感知并应答环境温度, 环境冷信号被细胞质膜受体感知, 并转化为生物化学信号进入细胞内.不同植物感受冷信号的受体不同, 在单子叶植物水稻中COLD1可能是冷信号受体, COLD1编码G蛋白信号调控因子, 该因子定位于质膜和内质网, 可与G蛋白α亚基互作并激活质膜Ca2+通道.在双子叶植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中, 低温导致质膜状态发生变化, 引起G蛋白活化或直接活化质膜Ca2+通道蛋白CNGC; 质膜通道蛋白活化后Ca2+从细胞壁内流进入细胞, 作为第二信使通过CRPK1激酶和MAP3K-MKK4/5级联途径, 分别磷酸化激活14-3- 3s和MPK3/6, 活化的14-3-3s和MPK3/6穿过核膜从胞质进入核内, 分别参与CBF (C-repeat binding factors)和ICE1的泛素化降解(Yu et al., 2001).ICE1- CBFs-COR通路处于冷信号转导网络的中心位置.CBF是一个转录因子, 可结合低温胁迫响应基因COR (cold-regulated)启动子顺式作用元件, 激活COR基因表达(Shi et al., 2015; 刘静妍等, 2017; Gao et al., 2018; Guo et al., 2018).合成的PR-AFPs和PR通过内质网运输到高尔基体形成囊泡, 包裹蛋白的囊泡与质膜融合, 并将PR-AFPs或PR蛋白分泌释放到胞外壁表面(Pihakaski-Maunsbach et al., 1996).当环境降温和/或受到病原菌侵染(Yu and Griffith, 1999; Hiilovaara-Teijo et al., 1999), PR-AFPs或PR蛋白可特异吸附到冰晶和病原菌上, 防止冰晶生长和病原菌侵染(图3A).除环境冷信号诱导植物AFPs表达外, 常温下乙烯、茉莉酸和干旱可诱导合成PR-AFPs (Dave and Mitra, 1998), 而水杨酸、脱落酸和雪腐病原菌仅诱导合成PR (Hiilovaara-Teijo et al., 1999; 卢存福等, 2000; Yu and Griffith, 2001; Yu et al., 2001) (图3B). ... Ice-binding proteins: a remarkable diversity of structures for stopping and starting ice growth 1 2014 ... 生长的冰晶将接近的溶质从冰面附近推开, 使水分子不断进入到晶格中, 导致冰晶体增大.而AFPs与冰晶具有特殊的亲和力, 能非常稳定地结合在冰晶表面.冰晶表面以直平面的形式向前伸展生长, AFPs结合冰面后产生一个小于正常冰晶半径的曲率半径, 这种从直平面到曲面的改变导致与水接触的冰表面积和表面张力增大, 从而使更多的能量被释放; 冰晶表面积的增大使体系的平衡状态发生改变, 从而使整个体系的冰点降低, 产生热滞效应(Davies, 2014).AFP分子存在晶格亲和面(ice-binding face, IBF)和疏水面(non-ice-binding face, NIBF), IBF可促进晶格形成并与之吸附结合, 而暴露在水相的NIBF则扰乱水分子形成类晶格排列, 从而阻止冰晶生长(Liu et al., 2016).AFP表现出既可激发冰核形成又抑制冰晶体生长的独特功能(Eickhoff et al., 2019). ... Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes 1 1983 ... AFPs-冰晶结合力的调节是AFPs抗冻机制的关键, 也是理解AFPs结构与功能的重点.早期研究表明, 氢键是AFPs与冰晶结合的作用力, AFPI亲水性残基Thr和Asp在二级螺旋上呈规律性间隔, Thr羟基与Asp羧基间的距离为4.5?, 这与冰晶平面上氧原子的间距正好匹配, 两者之间形成氢键, 从而使AFPs稳定结合冰面(DeVries, 1983).同时, AFPI存在螺旋轴亲水基团和疏水基团的偶极子, AFPI偶极子与冰晶周围水分子的偶极子相互作用, 两亲性的α-螺旋经亲水侧链定位, 提供与晶格相互作用的氢键, 而疏水侧链则阻止冰晶的生长.然而氢键数量和作用强度不足以保证AFPs-冰晶不可逆结合的稳定性(Collins and Margesin, 2019).Thr残基上的羟基可凸入冰晶晶格内部, 并占据晶格中氧原子的位置, 因而可以毫无障碍地与邻近晶格中的氧原子同时形成3个氢键, 并将 AFP有效地固定在晶格的顶层.糖侧链在结合冰晶中也发挥重要作用(Giubertoni et al., 2019). ... Antifreeze glycopeptides and peptides: interactions with ice and water 2 1986 ... 植物AFPs亲和吸附在冰晶表面, 可降低细胞溶液的冰点, 而其熔点几乎不变, 这种性质称为热滞活性(TH) (DeVries, 1986).当环境温度低于冰点时, 溶液中开始形成细小晶核, AFPs能够阻止冰晶融合与生长, 防止形成大冰晶, 并修饰冰晶形态, 这种性质即为重结晶抑制活性(RI) (Knight and Duman, 1986).目前, 已发现60多种植物在低温环境下积累抗冻活性物质, 我们对不同植物中抗冻蛋白的性质、来源及同源蛋白进行了总结(表1). ...
TH和RI同表1. ... Purification and characterization of a thermal hysteresis protein from a plant, the bittersweet nightshade Solanum dulcamara 1 1994 ... Properties of different plant antifreeze proteins (AFPs)
TH和RI同表1. ... Snow-mold-induced apoplastic proteins in winter rye leaves lack antifreeze activity 4 1999 ... 在严寒环境中, 植物合成多种类型AFPs应对冷胁迫.例如, 低温环境下冬黑麦叶片质外体提取液具有抗冻活性, 已鉴定出6种抗冻蛋白, 包括2种葡聚糖酶(β-1,3-或β-1,4-葡聚糖酶)、2种几丁质酶和2种类甜蛋白(Hon et al., 1995).这些低温诱导表达的AFPs与具有病原菌防御功能的病程相关蛋白(PR)类似.为明确这类AFPs是否与病原菌诱导的PR同源, 研究者分别利用低温处理和雪腐病原菌接种冬黑麦, 发现低温和病原菌均可诱导基因表达, 诱导合成的蛋白主要包括葡聚糖酶、几丁质酶、类甜蛋白(Hon et al., 1995; Huang and Duman, 2002)和多聚半乳糖醛酸酶(Worrall et al., 1998; Meyer et al., 1999).多肽序列比对显示,常温下病原菌诱导的PR蛋白与AFPs高度同源, 氨基酸序列也基本一致.值得注意的是, 对诱导蛋白进行酶活性和抗冻活性测试, 发现病原菌诱导的PR蛋白只有抑菌相关的水解酶活性, 而无抗冻活性; 病原菌诱导的冬黑麦叶片中积累的PR蛋白与低温诱导的AFP氨基酸序列极为相似, 但其缺乏抗冻活性(Hiilovaara-Teijo et al., 1999); 类似地, 用外源水杨酸或脱落酸处理冬黑麦叶片, 其积累的PR蛋白也不具有抗冻活性(Hiilovaara-Teijo et al., 1999; Yu and Griffith, 2001; Yu et al., 2001).而低温诱导合成的AFPs既有抗菌活性, 也表现出抗冻活性, 具有抑冰-抗病双重分子功能(PR-AFP) (Griffith et al., 1992; Tyshenko et al., 1997). ...
TH和RI同表1. ... Extraction and isolation of antifreeze proteins from winter rye (Secale cereale L.) leaves 1 1994 ... Properties of different plant antifreeze proteins (AFPs)
TH和RI同表1. ... Maize tolerance against drought and chilling stresses varied with root morphology and antioxidative defense system 1 2020 ... 温度是决定植物地理分布的主要环境因子之一(Yan et al., 2006).在高纬度寒地植物或温带多年生越冬植物的生活史周期中, 低温是其频繁遭遇的非生物逆境.根据引起危害的温度范围, 低温伤害分为冷害(0-15°C)和冻害(<0°C).在零度以上低温环境中, 虽然植物不会面临体内结冰及冰晶对细胞和分子结构的机械损伤等严重问题, 但是对于水稻(Oryza sativa)和玉米(Zea mays)等起源于热带和亚热带地区的植物而言, 10°C以下低温就足以引起细胞代谢紊乱和生理损伤, 过氧化代谢加剧, 活性氧等自由基过量产生与积累.过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子(O2-. )等活性氧具有很强的氧化活性, 过量积累会攻击膜蛋白和还原性膜脂(王红等, 1994; Pinhero et al., 1997), 引起膜变脆固化,柔韧性和流动性降低, 易出现裂缝和洞隙, 导致膜蛋白变性, 膜选择透性降低, 大量细胞内溶物外渗, 细胞骨架重组(Thomashow, 1999), 还使光合作用降低, 造成严重生理变化(Pinhero et al., 1997; Aroca et al., 2005; Gill and Tuteja, 2010; Hussain et al., 2020).当环境温度降到零度以下时, 植物体内水分子开始凝聚结冰.一般情况下, 由于细胞内溶液凝固点通常低于胞外溶液, 随着低温的持续, 晶核先在胞外空间形成并不断生长增大, 一方面造成胞外溶液水势降低, 胞内外水势差驱动胞内水分大量外流, 原生质过度脱水, 使蛋白质等生物大分子变性, 胞内生理状态恶化.另一方面, 不断生长的胞外大冰晶直接对细胞产生机械作用, 破坏细胞质膜和胞内亚细胞结构, 最终导致细胞破裂死亡. ... Resistance in winter cereals and grasses to low-temperature parasitic fungi 1 1974 ... 高纬度越冬植物在冰雪覆盖层下或茎叶枯萎后仅宿根在冻土层中度过漫长的严冬.相对于近地大气而言,冰雪冻土层中温、湿度较高且波动较小, 通常温度稳定在接近零度以下低温, 相对湿度处于饱和状态.在冰雪冻土环境中, 植物体内仅维持极低的物质与能量代谢水平, 以维系其基础生命活动, 植物处于近休眠状态; 但在低温高湿环境下, 与植物伴生的嗜冷病原微生物, 如粉红色雪霉菌(Microdochium nivale)、斑点雪霉菌(Typhula spp.)和核盘菌雪霉菌(Sclerotinia borealis)却可以保持活跃的生命代谢活动, 能够迅速繁殖并侵染冬黑麦等宿主植物(Jamalainen, 1974).在冰雪冻土层下, 病原菌向宿主胞间分泌和释放冰核蛋白(ice-binding proteins, IBPs), IBPs通过多肽链N端结构域成簇聚集锚定到宿主细胞膜外侧, 由β-螺旋重复结构组成的结合域吸附冰晶并使水分子呈晶格位序排列, 提高胞外溶液冰点温度, 引发宿主胞间冰核和细小冰晶颗粒大量生成, 细小冰晶颗粒通过重结晶相互融合, 迅速生长形成大冰晶体, 破坏宿主植物细胞结构, 加重病原菌侵染.这导致冰雪冻土层中越冬的宿主植物同时受到严寒和病原菌侵染双重威胁. ... Cold-regulated proteins with potent antifreeze and cryoprotective activities in spruces (Picea spp.) 3 2009 ... Properties of different plant antifreeze proteins (AFPs)
TH和RI同表1. ... Antifreeze activity of cold acclimated Japanese radish and purification of antifreeze peptide 2 2009 ... Properties of different plant antifreeze proteins (AFPs)
TH和RI同表1. ...
TH和RI同表1. ... Targeted expression of redesigned and codon optimised synthetic gene leads to recrystallisation inhibition and reduced electrolyte leakage in spring wheat at sub-zero temperatures 1 2006 ... Transgenic plants expressing a gene encoding an antifreeze protein (AFP)
TH和RI同表1. ... Inhibition of recrystallization of ice by insect thermal hysteresis proteins: a possible cryoprotective role 1 1986 ... 植物AFPs亲和吸附在冰晶表面, 可降低细胞溶液的冰点, 而其熔点几乎不变, 这种性质称为热滞活性(TH) (DeVries, 1986).当环境温度低于冰点时, 溶液中开始形成细小晶核, AFPs能够阻止冰晶融合与生长, 防止形成大冰晶, 并修饰冰晶形态, 这种性质即为重结晶抑制活性(RI) (Knight and Duman, 1986).目前, 已发现60多种植物在低温环境下积累抗冻活性物质, 我们对不同植物中抗冻蛋白的性质、来源及同源蛋白进行了总结(表1). ... Solute effects on ice recrystallization: an assessment technique 1 1988 ... 当环境温度降到冰点以下时, 植物细胞溶液中先形成细小晶核, 晶核相互融合长大, 冰晶体增大会对植物组织和细胞产生严重的物理损伤(Griffith et al., 1997; Hoshino et al., 1999).植物AFPs具有极强的重结晶抑制活性, 在极低浓度(100 μg?mL-1)下即可有效抑制冰晶重结晶(Knight et al., 1988), 形成的晶粒体积小且较均匀(Rahman et al., 2019), 有效防止形成大冰晶.胡萝卜(Daucus carota)、冬小麦(Triticum aestivum)及沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)等植物的抗冻蛋白在极低浓度下即具有很强的RI活性(Gruneberg et al., 2021).昆虫等动物的AFPs为高TH活性和低RI活性; 而植物AFPs具有很高的RI活性(Bahari et al., 2015; Ye et al., 2020), 这对保护植物尤为重要.植物AFPs热滞值通常为0.1-0.5°C, 而寒地植物或越冬植物遭遇的环境低温常远低于其冰点温度, 依赖AFPs降低溶液冰点难以阻止成冰.当环境温度低于冰点时, 植物体内形成细小晶核和冰晶体, 而AFPs可抑制小冰晶融合与生长, 因此大冰晶形成被阻断. ... Isolation and characterization of ice structuring proteins from cold-acclimated winter wheat grass extract for recrystallization inhibition in frozen foods 2 2007 ... Properties of different plant antifreeze proteins (AFPs)
TH和RI同表1. ... Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site 1 2012 ... Middleton等(2012)研究了黑麦草LpAFP的晶体结构, 发现有1个β-roll结构域, 它含有2个保守的Asn残基和1个疏水内核, 起稳定结构域的作用.LpAFP的冰结合面(ice-binding surface, IBS)位于β-roll结构域的1个β片层上, LpAFP通过IBS与冰晶的基面和棱面吸附结合.胡萝卜DcAFP的IBS结构域中Asn残基负责连接到晶格中(Zhang et al., 2004).以LpAFP蛋白晶体结构为模型, 使用同源建模对47种植物AFP的三维结构进行预测, 成功构建了9种植物AFP蛋白的三维结构, 发现胡萝卜、欧白英和冬黑麦AFP蛋白的三维结构以β-折叠为主(Gupta and Deswal, 2014a).植物AFP的β片层结构在AFPs家族广泛存在, β片层结构是冷水鱼II型和III型、昆虫(Cheung et al., 2017)和微生物海洋单胞菌(Marinomonas primoryensis) (Garnham et al., 2008) AFPs的主要结构, 包含与冰晶结合的重要结构构件. ... A framework for classification of antifreeze proteins in over wintering plants based on their sequence and structural features 1 2011 ... 植物AFPs可以形成α-螺旋、β-折叠和球状结构.利用生物信息学工具对27种植物AFPs进行二级结构预测, 结果显示, 15种为β-折叠, 5种由β-折叠和α-螺旋组成, 7种为α-螺旋(Muthukumaran et al., 2011).β-折叠扁平的构造更易于与冰表面结合(Gupta and Deswal, 2014a).图2显示部分AFPs的二级结构.红外光谱分析发现, 黑麦草LpAFP二级结构主要为β-折叠(Pudney et al., 2003).圆二色谱显示, 冬小麦、沙冬青和沙棘的AFPs也具有丰富的β片层结构(费云标等, 2000; Kontogiorgos et al., 2007; Gupta and Deswal, 2014b), 其中沙冬青的AFP中含34%反向平行β-折叠及11% α-螺旋(费云标等, 2000). ... Characterization of cold-responsive extracellular chitinase in bromegrass cell cultures and its relationship to antifreeze activity 1 2008 ... Properties of different plant antifreeze proteins (AFPs)
TH和RI同表1. ... Expression of insect (Microdera puntipennis dzungarica) antifreeze protein MpAFP149 confers the cold tolerance to transgenic tobacco 1 2008 ... Transgenic plants expressing a gene encoding an antifreeze protein (AFP)
TH和RI同表1. ... Purification, immunolocalization, cryoprotective, and antifreeze activity of PCA60: a dehydrin from peach (Prunus persica) 1 1999 ... Properties of different plant antifreeze proteins (AFPs)
TH: 热滞活性; RI: 重结晶抑制活性 ... A carrot leucine-rich-repeat protein that inhibits ice recrystallization 7 1998 ... Griffith等(1992)首次从冬黑麦(Secale cereale)中分离纯化出具有抗冻活性的AFP, 此后研究者从几十种寒地植物或越冬植物中分离出抗冻蛋白, 包括蕨类植物、裸子植物和被子植物(Gong et al., 1996; Griffith and Yaish, 2004; Raymond et al., 2009).分子演化分析表明, 不同类型的抗冻蛋白具有相似的分子功能, 但它们并非同源分子, 其多肽链中不含具有家族特征性的氨基酸残基保守序列.抗冻蛋白活性的结构基础在于三维空间上靠近的氨基酸残基构成亲冰结构域和疏水结构域, 分别负责分子与冰晶亲和吸附和扰乱晶格附近水分子位序, 使抗冻蛋白获得抑冰活性.与鱼类和昆虫等动物和菌类抗冻蛋白相比, 植物抗冻蛋白在分子功能方面有2个显著特征.一是植物抗冻蛋白虽然热滞活性(thermal hysteresis, TH)较低, 但有极高的重结晶抑制活性(recrystallization inhibition, RI) (Worral et al., 1998).多数植物抗冻蛋白分子量较大, 其表面通常包含多个亲水性冰晶亲和结构域, 可结合和包裹多个晶核并高效阻止重结晶.二是多数植物具有抗冻活性和抗病抑菌(pathogenesis-related, PR)活性双重功能.PR-AFPs主要包括β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶、类甜蛋白和多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白等具有PR活性的抗冻蛋白(李文轲和马春森, 2012).有趣的是, 病原菌诱导合成的这类蛋白仅有PR活性而无抗冻活性; 冷诱导合成的蛋白具有PR和AFP双重活性.在积雪层下等低温环境中, 植物物质代谢和能量代谢等生命活动趋于减缓甚至停滞; 然而, 植物根际土壤中病原菌比其寄主的活动温度更低, 病原微生物仍保持较高的代谢水平和侵染能力, 在长期的冷冻和病原菌侵染双重逆境压力下, 植物演化出PR-AFPs双重分子功能这种高效的应对策略.由于独特的分子功能以及在抗寒中发挥的重要作用, 植物抗冻蛋白成为植物抗寒研究的热点.本文综述了植物抗冻蛋白的分子结构与理化性质、低温诱导合成调控、AFPs-冰晶结合与抑冰机理等研究进展, 为深入理解植物抗冻机理和抗寒育种应用提供参考. ...
TH和RI同表1. ... Cold-active winter rye glucanases with ice-binding capacity 1 2006 ... 目前, 已分离鉴定的多数植物AFPs均与病程相关蛋白PR同源, 从冷驯化的冬黑麦(Hon et al., 1995)、欧白英(Solanum dulcamara) (Huang et al., 2002)、萝卜(Raphanus sativus) (Kawahara et al., 2009)和胡萝卜(Worrall et al., 1998)等植物中分离的蛋白(如几丁质酶)具有AFPs活性和水解酶活性双重功能.同样, 从冬黑麦中分离的β-1,3-葡聚糖酶除具有抗冻活性外, 还保留了原分子15%-35%的水解酶活性.这些结果暗示PR-AFP水解酶/抗冻活性转换调控与某些翻译后事件有关(Yaish et al., 2006).从冷适应的冬黑麦中分离纯化2个几丁质酶(CHT9和CHT46)具有抗冻活性.之前的研究显示, CHT9多肽链铰链区包含4个脯氨酸残基, 其中2个可被羟基化.为探明羟基化是否调控CHT9抗冻活性, 研究者从冷驯化冬黑麦cDNA文库中克隆了CHT9和CHT46基因, 其CDS区包含1 193 bp和998 bp碱基, 预测蛋白分子量分别为31.7 kDa和24.9 kDa.利用质谱法测定的CHT9蛋白分子量比预测高34 kDa, 正好等于2个羟基的分子量, 表明冷诱导冬黑麦合成的CHT9铰链区2个脯氨酸残基被羟基化修饰.而CHT46实测分子量与预测的一致, 表明CHT46翻译后其氨基酸残基未发生任何修 ... Comparative proteomic analysis provides new insights into chilling stress responses in rice 1 2006 ... 温度是决定植物地理分布的主要环境因子之一(Yan et al., 2006).在高纬度寒地植物或温带多年生越冬植物的生活史周期中, 低温是其频繁遭遇的非生物逆境.根据引起危害的温度范围, 低温伤害分为冷害(0-15°C)和冻害(<0°C).在零度以上低温环境中, 虽然植物不会面临体内结冰及冰晶对细胞和分子结构的机械损伤等严重问题, 但是对于水稻(Oryza sativa)和玉米(Zea mays)等起源于热带和亚热带地区的植物而言, 10°C以下低温就足以引起细胞代谢紊乱和生理损伤, 过氧化代谢加剧, 活性氧等自由基过量产生与积累.过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子(O2-. )等活性氧具有很强的氧化活性, 过量积累会攻击膜蛋白和还原性膜脂(王红等, 1994; Pinhero et al., 1997), 引起膜变脆固化,柔韧性和流动性降低, 易出现裂缝和洞隙, 导致膜蛋白变性, 膜选择透性降低, 大量细胞内溶物外渗, 细胞骨架重组(Thomashow, 1999), 还使光合作用降低, 造成严重生理变化(Pinhero et al., 1997; Aroca et al., 2005; Gill and Tuteja, 2010; Hussain et al., 2020).当环境温度降到零度以下时, 植物体内水分子开始凝聚结冰.一般情况下, 由于细胞内溶液凝固点通常低于胞外溶液, 随着低温的持续, 晶核先在胞外空间形成并不断生长增大, 一方面造成胞外溶液水势降低, 胞内外水势差驱动胞内水分大量外流, 原生质过度脱水, 使蛋白质等生物大分子变性, 胞内生理状态恶化.另一方面, 不断生长的胞外大冰晶直接对细胞产生机械作用, 破坏细胞质膜和胞内亚细胞结构, 最终导致细胞破裂死亡. ... Crystal structure of an insect antifreeze protein reveals ordered waters on the ice-binding surface 1 2020 ... 当环境温度降到冰点以下时, 植物细胞溶液中先形成细小晶核, 晶核相互融合长大, 冰晶体增大会对植物组织和细胞产生严重的物理损伤(Griffith et al., 1997; Hoshino et al., 1999).植物AFPs具有极强的重结晶抑制活性, 在极低浓度(100 μg?mL-1)下即可有效抑制冰晶重结晶(Knight et al., 1988), 形成的晶粒体积小且较均匀(Rahman et al., 2019), 有效防止形成大冰晶.胡萝卜(Daucus carota)、冬小麦(Triticum aestivum)及沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)等植物的抗冻蛋白在极低浓度下即具有很强的RI活性(Gruneberg et al., 2021).昆虫等动物的AFPs为高TH活性和低RI活性; 而植物AFPs具有很高的RI活性(Bahari et al., 2015; Ye et al., 2020), 这对保护植物尤为重要.植物AFPs热滞值通常为0.1-0.5°C, 而寒地植物或越冬植物遭遇的环境低温常远低于其冰点温度, 依赖AFPs降低溶液冰点难以阻止成冰.当环境温度低于冰点时, 植物体内形成细小晶核和冰晶体, 而AFPs可抑制小冰晶融合与生长, 因此大冰晶形成被阻断. ... Chitinase genes responsive to cold encode antifreeze proteins in winter cereals 3 2000 ... 饰.总之, 羟基化CHT9和未羟基化修饰的CHT46具有相似的冰晶结合与抑冰活性, 暗示羟基化修饰不参与CHT-AFP抗冻活性调控(Yeh et al., 2000).从沙棘(Hippophae rhamnoides)幼苗中分离的另一种抗冻蛋白CHT1b-AFP可被糖基化, 去糖基的CHT1b抗冻活性不受影响; 采用圆二色法分析蛋白质二级结构, 发现CHT1b和CHT1a分子中包含36%-43%的β- stranded结构, 冷驯化期β-stranded结构增大11%, CHT1b和CHT1a抗冻活性比未经冷驯化分别增高2倍和4倍; 添加Ca2+也可提高分子中β-stranded结构含量, 并降低CHT-AFP水解酶活性, 却可以增高CHT1a抗冻活性(Gupta and Deswal, 2014b).越来越多的研究表明, PR-AFP蛋白水解酶活性/RI活性转换调控可能与其互作分子参与的多肽重新折叠和构型改变有关. ...
TH和RI同表1. ... Expression, purification, and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants 1 2004 ... Middleton等(2012)研究了黑麦草LpAFP的晶体结构, 发现有1个β-roll结构域, 它含有2个保守的Asn残基和1个疏水内核, 起稳定结构域的作用.LpAFP的冰结合面(ice-binding surface, IBS)位于β-roll结构域的1个β片层上, LpAFP通过IBS与冰晶的基面和棱面吸附结合.胡萝卜DcAFP的IBS结构域中Asn残基负责连接到晶格中(Zhang et al., 2004).以LpAFP蛋白晶体结构为模型, 使用同源建模对47种植物AFP的三维结构进行预测, 成功构建了9种植物AFP蛋白的三维结构, 发现胡萝卜、欧白英和冬黑麦AFP蛋白的三维结构以β-折叠为主(Gupta and Deswal, 2014a).植物AFP的β片层结构在AFPs家族广泛存在, β片层结构是冷水鱼II型和III型、昆虫(Cheung et al., 2017)和微生物海洋单胞菌(Marinomonas primoryensis) (Garnham et al., 2008) AFPs的主要结构, 包含与冰晶结合的重要结构构件. ... Carrot antifreeze protein does not exhibit the polygalacturonase-inhibiting activity of PGIP family 1 2006 ... AFPs家族最具特征性的分子结构是冰晶结合域(ice-binding domain, IBD)和再结晶抑制结构域(ice- recrystallization inhibition, IRI).胡萝卜抗冻蛋白(DcAFP)的IBD起源于多聚半乳糖醛酸酶抑制因子(PGIP)的富含亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat, LRR) (Worral et al., 1998; Meyer et al., 1999).分子进化分析表明, DcPGIP蛋白LRR结构域中含有非保守残基, 是LRR中保守的微酸性亮氨酸残基被替换为非保守碱性残基, 蛋白表面电荷由负变正, 由于同性电荷相斥, 使DcPGIP失去与原底物多聚半乳糖醛酸酶的结合性能, 而对冰晶表面具有特异吸附的亲和力, 并逐步演化为DcAFP的IBD结构域(Zhang et al., 2006; Sandve et al., 2008).AFP的IRI结构域起源于3 600万年前的1次转座或序列重复事件, 转座元件(transposable element, TE)插入水稻OsLRR-PSR (phytosulphokine receptor kinase)编码序列, 或通过不等交换方式增加了OsLRR-PSR的LRR重复基序的拷贝数, 这可能导致原蛋白激酶活性转变为IRI活性.研究表明, 禾本科早熟禾亚族的AFP具有IRI结构域, 而早熟禾族其它成员的同源蛋白不含IRI结构域.因此, 有观点认为早熟禾亚族从早熟禾族分离后, IRI结构域才逐渐从早熟禾亚族AFP蛋白中演化而来(Sandve et al., 2008).选取47种植物的AFP序列进行分子系统发育分析, 发现不同植物的AFP序列结构差异很大, 其中12种植物AFP的IRI结构域来自早熟禾亚族.植物AFP由多个祖先分子演化而来, 同源性较低, 不同植物的AFP具有独特的演化特性(Gupta and Deswal, 2014a), 较早出现的植物AFP的IBD源于OsLRR-PSR的LRR结构域改变. ... An apoplastic chitinase CpCHT1 isolated from the corolla of wintersweet exhibits both antifreeze and antifungal activities 1 2011 ... Properties of different plant antifreeze proteins (AFPs)
TH和RI同表1. ...
本文的其它图/表
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图1
白菜型冬油菜叶片质外体蛋白质粗提物冰晶形态修饰和重结晶抑制活性
(A) 低温处理幼苗叶片质外体粗提液在-7°C恒温50分钟后的冰晶生长情况(具有高重结晶抑制活性); (B) 常温处理幼苗叶片质外体粗提液在-7°C恒温50分钟后的冰晶生长情况; 图中有不规则冰晶体、尖长锥形冰晶体、近椭圆形冰晶体、梭形冰晶体和棒状冰晶体。Bars=10 μm
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图2
几种植物抗冻蛋白(AFPs)的分子结构
(A) 黑麦草LpAFP (AJ277399.1); (B) 胡萝卜DcAFP (AF055480.1); (C) 欧白英I型内切几丁质-AFP (Q84LQ7); (D) 小麦类甜蛋白-AFP (AAM15877.1); (E) 白菜型冬油菜BrAFP1 (gi62361691); (F) 冬黑麦葡聚糖酶-AFP (CAJ58506.1); (G) 冬黑麦II型内切几丁质-AFP (AF280438.1); (H) 小球藻AFP (ABR01234.1)。通过在线软件Phyre 2.0 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id =index)运行GenBank序列生成植物AFPs模型。
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图3
低温下植物抗冻蛋白(AFPs)和致病相关蛋白(PRs)的分子调控模型(Griffith and Yaish, 2004; Guo et al., 2018)
(A) 低温胁迫诱导COR、AFP和CSP等基因表达, 新合成的PR-AFP蛋白和PR蛋白通过内质网、高尔基体和囊泡分泌运输, 穿过质膜并聚集在细胞壁外空间, 形成寡聚体复合物, 抑制低温下病原菌生长; 这些蛋白质包括几丁质酶-AFPs (CHT-AFP)、葡聚糖酶-AFPs (GLU-AFP)和类甜蛋白-AFPs (TLP-AFP); 当环境温度降至冰点以下, PR-AFPs蛋白可特异吸附到冰晶表面, 抑制冰晶生长和重结晶; (B) PR蛋白(包括几丁质酶(CHT)、葡聚糖酶(GLU)和类甜蛋白(TLP))被合成并分泌到质外体中, 常温下用水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)或雪腐病原菌处理植物, 仅诱导合成PR蛋白, 可抑制真菌病原体生长。
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表2
表达编码抗冻蛋白(AFP)基因的转基因植物
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