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沙棘hrh-miRn458靶向转录因子WRI1调控油脂合成
于淼, 阮成江, 丁健, 李景滨, 卢顺光, 温秀凤
植物学报    2022, 57 (5): 635-648.   DOI: 10.11983/CBB22004
摘要   (481 HTML18 PDF(pc) (2107KB)(316)  

转录因子WRI1 (WRINKLED 1)在油脂合成过程中发挥重要调控作用, 其转录和翻译水平调控机理以及下游的靶基因现已基本明确, 但尚未见其转录后调控的报道。为探讨沙棘(Hippophae rhamnoides) hrh-miRn458与转录因子WRI1之间的靶向关系, 并阐明其在果肉和种子发育过程中的表达模式, 通过生物信息学方法预测hrh-miRn458成熟体序列及其与候选靶基因WRI1的结合位点, 采用双荧光素酶报告基因检测和RNA pull down技术相结合的方法验证hrh-miRn458与WRI1基因之间的靶向关系, 并应用qRT-PCR方法分析hrh-miRn458与WRI1在沙棘不同发育期果肉和种子油脂合成过程中的表达变化。结果表明, 生物信息学预测WRI1基因的CDS区第309-327位与hrh-miRn458成熟体序列的15个碱基互补; 荧光检测显示pmirGLO-WRI1-WT+hrh-miRn458 mimics显著抑制荧光素酶活性(P<0.001); RNA pull down实验证实hrh-miRn458与WRI1存在互作关系; 不同发育期果肉和种子中hrh-miRn458的表达量总体呈先下降后上升趋势, 其靶基因WRI1的表达量则呈先上升后降低趋势; 同一时期, 果肉中hrh-miRn458的表达量明显低于种子, 而果肉中的WRI1表达量则明显高于种子。综上, 沙棘hrh-miRn458靶向转录因子WRI1, 且二者在果肉和种子油脂合成过程中存在负调控关系。研究结果为深入理解沙棘种子油脂合成机制及培育高油品种提供了参考依据。



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图4 pmirGLO-WRI1-WT/MUT+hrh-miRn458序列鉴定及荧光素酶活性分析
(A) pmirGLO-WRI1-WT/MUT+hrh-miRn458 PCR产物序列, 黄色部分为突变序列; (B) pmirGLO-WRI1-WT/MUT质粒酶切鉴定(a: XhoI酶切质粒; b: 野生型DNA质粒; c: NheI酶切质粒; d: 突变型DNA质粒); (C) 荧光素酶活性分析(1: pmirGLO- WRI1-WT+mimics NC质粒; 2: pmirGLO-WRI1-WT+hrh-miRn458 mimics质粒; 3: pmirGLO-WRI1-MUT+mimics NC质粒; 4: pmirGLO-WRI1-MUT+hrh-miRn458 mimics质粒)。*** 差异极显著(P<0.001); ns: 无显著差异(P>0.05)。
正文中引用本图/表的段落
含有hrh-miRn458结合位点的野生型和突变型序列载体测序峰图显示, WRI1基因在目的突变区域由CTTCTTCTT成功突变为TCCTAATAC, 表明已成功构建野生型和突变型双荧光素酶报告载体(图4A)。提取pmirGLO-WRI1-WT/MUT质粒后经XhoI和NheI双酶切, 得到的片段大小和分子量与目的基因一致, 表明成功构建了这2种质粒(图4B)。与重组质粒pmirGLO-WRI1-WT+mimics NC相比, pmirGLO- WRI1-WT+hrh-miRn458 mimics的相对荧光活性显著降低(P<0.001) (图4C), 而当WRI1基因CDS区的潜在结合位点发生突变后, pmirGLO-WRI1-MUT+ hrh-miRn458 mimics与pmirGLO-WRI1-MUT+mimics NC间的相对荧光活性未发生明显变化(图4B)。上述结果表明, hrh-miRn458与WRI1基因CDS区结合, 抑制WRI1基因的表达。
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