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沙棘hrh-miRn458靶向转录因子WRI1调控油脂合成
于淼, 阮成江, 丁健, 李景滨, 卢顺光, 温秀凤
植物学报    2022, 57 (5): 635-648.   DOI: 10.11983/CBB22004
摘要   (484 HTML18 PDF(pc) (2107KB)(316)  

转录因子WRI1 (WRINKLED 1)在油脂合成过程中发挥重要调控作用, 其转录和翻译水平调控机理以及下游的靶基因现已基本明确, 但尚未见其转录后调控的报道。为探讨沙棘(Hippophae rhamnoides) hrh-miRn458与转录因子WRI1之间的靶向关系, 并阐明其在果肉和种子发育过程中的表达模式, 通过生物信息学方法预测hrh-miRn458成熟体序列及其与候选靶基因WRI1的结合位点, 采用双荧光素酶报告基因检测和RNA pull down技术相结合的方法验证hrh-miRn458与WRI1基因之间的靶向关系, 并应用qRT-PCR方法分析hrh-miRn458与WRI1在沙棘不同发育期果肉和种子油脂合成过程中的表达变化。结果表明, 生物信息学预测WRI1基因的CDS区第309-327位与hrh-miRn458成熟体序列的15个碱基互补; 荧光检测显示pmirGLO-WRI1-WT+hrh-miRn458 mimics显著抑制荧光素酶活性(P<0.001); RNA pull down实验证实hrh-miRn458与WRI1存在互作关系; 不同发育期果肉和种子中hrh-miRn458的表达量总体呈先下降后上升趋势, 其靶基因WRI1的表达量则呈先上升后降低趋势; 同一时期, 果肉中hrh-miRn458的表达量明显低于种子, 而果肉中的WRI1表达量则明显高于种子。综上, 沙棘hrh-miRn458靶向转录因子WRI1, 且二者在果肉和种子油脂合成过程中存在负调控关系。研究结果为深入理解沙棘种子油脂合成机制及培育高油品种提供了参考依据。



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图1 不同发育期杂56果实和种子的表型(A)及含油率(B)
不同小写字母表示同一时期果肉和种子含油率在0.05水平差异显著。daa: 花后天数。Bar=3 mm
正文中引用本图/表的段落
随着果实的不断增大, 沙棘杂56果肉颜色先由绿色转为橙黄色, 再转变为橙红色; 种皮颜色则先由绿色转变为橙黄色, 再变为黑褐色; 果实外皮的白色鳞状毛逐渐消失, 色素大量合成, 逐渐成熟稳定(图1A)。沙棘果肉油脂迅速积累, 种子油脂积累缓慢, 花后54-90天, 果肉含油率从10.46%上升到28.12%, 种子含油率则由7.26%增加至10.42% (图1B)。尤其是花后54-80天期间, 果肉含油率从10.46%快速增加至27.03%, 增幅为16.57%, 随后缓慢增加, 并在花后90天达到28.12%, 10天内含油率上升了1.09%; 花后54-65天, 种子含油率从7.26%增加到9.97%, 增幅为2.71%, 随后缓慢增加, 花后80天上升至10.20% (15天内含油率上升了0.23%), 并在花后90天达到最高值(10.42%) (10天内含油率上升了0.22%)。
含有hrh-miRn458结合位点的野生型和突变型序列载体测序峰图显示, WRI1基因在目的突变区域由CTTCTTCTT成功突变为TCCTAATAC, 表明已成功构建野生型和突变型双荧光素酶报告载体(图4A)。提取pmirGLO-WRI1-WT/MUT质粒后经XhoI和NheI双酶切, 得到的片段大小和分子量与目的基因一致, 表明成功构建了这2种质粒(图4B)。与重组质粒pmirGLO-WRI1-WT+mimics NC相比, pmirGLO- WRI1-WT+hrh-miRn458 mimics的相对荧光活性显著降低(P<0.001) (图4C), 而当WRI1基因CDS区的潜在结合位点发生突变后, pmirGLO-WRI1-MUT+ hrh-miRn458 mimics与pmirGLO-WRI1-MUT+mimics NC间的相对荧光活性未发生明显变化(图4B)。上述结果表明, hrh-miRn458与WRI1基因CDS区结合, 抑制WRI1基因的表达。
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