|
|
||
|
基因枪介导的老芒麦遗传转化体系的建立
植物学报
2021, 56 (1):
62-70.
DOI: 10.11983/CBB20174
川草2号老芒麦(Elymus sibiricus)是青藏高原地区治理荒漠化和建设高产人工草地的主要栽培草种。用川草2号老芒麦5种外植体诱导愈伤组织, 经分化测试, 仅幼穗愈伤组织能分化再生。以当代培养25天和35天的结构致密坚硬的幼穗愈伤组织为受体, 分别进行农杆菌侵染和基因枪转化, 结果只有基因枪能转化成功。在基因枪转化过程中, 采用高渗培养和滤纸干燥2种方式预处理愈伤组织, 结果表明滤纸干燥处理比高渗处理转化效率高。当代诱导25天的幼穗愈伤组织, 滤纸干燥处理2小时转化效率最高, 达40%。该研究成功获得了基因枪转化的以川草2号老芒麦幼穗愈伤为受体的阳性愈伤组织。  View image in article
图1
PANIC6A (A)、PANIC6D (B)和PANIC6E (C) T-DNA区段
LB: T-DNA区段左边界; OsAct1: 水稻启动子; hph/bar: 筛选标记基因; PvUbi1: 柳枝稷启动子; pporRFP/GUSplus: 红色荧光/葡萄糖苷酸酶报告基因; ZmUbi1: 玉米启动子; Cmr: 氯霉素抗性基因; ccdB: 目的基因; RB: T-DNA区段右边界
正文中引用本图/表的段落
农杆菌和基因枪转化过程中所用载体为PANIC系列(Mann et al., 2012), 载体T-DNA区段如图1所示。
用热激法(Mann et al., 2012)将PANIC6A/6D/6E (图1A-C)分别转化根癌农杆菌EHA105 (本研究所用农杆菌和大肠杆菌菌株由中国科学院青岛生物能源与过程研究所能源与作物分子育种团队提供), 涂板约48小时后, 挑取单克隆接种到添加50 mg?L-1卡那霉素和50 mg?L-1利福平的600 μL LB培养液中, 于28°C、每分钟200转的摇床中摇菌约14小时。菌液检测呈阳性后, 取200 μL菌液加入含有50 mg?L-1卡那霉素和50 mg?L-1利福平的50 mL LB培养液中, 于28°C、每分钟200转的摇床中摇至OD600=0.4, 然后加入乙酰丁香酮(AS)至终浓度为100 μmol?L-1。继续摇约2小时至OD600=0.6时, 851 ×g 离心15分钟收集菌体。用侵染液(未加琼脂的继代培养基)重悬菌体, 至终浓度OD600=0.3, 乙酰丁香酮浓度为100 μmol?L-1时开始侵染。侵染受体为结构致密且状态较一致的川草2号老芒麦幼穗愈伤组织(约培养30天)和幼穗。农杆菌侵染方法参照Wang和Ge (2005)的方法并进行改动, 4种侵染方案具体见表1。
用热激法将PANIC6A (图1A)和PANIC6D (图1B)两种质粒(Mann et al., 2012)转化DH5α大肠杆菌。用试剂盒(Ml13101M, 莫纳生物公司)提取质粒, 经琼脂糖凝胶电泳检测后, 用紫外吸收法检测质粒DNA的浓度和纯度, 并置于-20°C冰箱中保存备用。
本文的其它图/表
|
首页
