基因枪介导的老芒麦遗传转化体系的建立 植物学报    2021, 56 (1): 62-70.   DOI: 10.11983/CBB20174

图7 基因枪轰击后荧光愈伤百分比随持续观测时间的变化趋势
误差线为标准误差, 样本容量为30。25天幼穗愈伤滤纸干燥2小时荧光愈伤比率均显著高于其它2种处理方式(* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001)。

正文中引用本图/表的段落

基因枪转化结果(图6A-H)表明, 对于诱导25天的幼穗愈伤, 经高渗处理后, 愈伤被轰击后第4天可观察到红色荧光(图6C, D), 轰击后4-7天荧光愈伤百分比呈上升趋势, 轰击7天后开始下降, 第9天趋于平稳, 荧光愈伤百分比约为20%。对于诱导25天的幼穗愈伤, 经滤纸干燥处理, 愈伤被轰击后第3天可观察到红色荧光(图6E, F), 轰击后3-6天荧光愈伤百分比持续增加, 轰击后6-8天荧光愈伤百分比不再增加, 轰击8天后开始下降, 到第9天趋于稳定, 荧光愈伤百分比约为40%。对于诱导35天的幼穗愈伤, 经滤纸干燥处理, 愈伤被轰击后第2天可观察到红色荧光(图6G, H), 轰击后2-6天荧光愈伤百分比呈上升趋势, 轰击7天后开始下降, 到第9天趋于稳定, 荧光愈伤百分比约为20% (图7)。综上表明, 在其它条件一致的情况下, 滤纸干燥处理相比常规高渗处理荧光愈伤比率高。对于2种预处理方式, 轰击后在一定时间段内(1-10天)其荧光愈伤比率的总趋势均为先增加后减少并最终趋于稳定, 轰击后2-4天可观察到红色荧光, 轰击后6-7天荧光愈伤比率达到高峰, 7-8天后呈减少趋势, 第9天荧光愈伤比率基本稳定。25天的幼穗愈伤对应各时间点荧光愈伤比率均高于35天的幼穗愈伤, 表明靶愈伤的状态是影响基因枪转化效率的关键因素之一, 且幼嫩幼穗愈伤转化效率更高。

单子叶植物不是农杆菌的天然宿主(de Cleene and de Ley, 1976), 因此限制了农杆菌在常规条件下对单子叶植物的遗传转化。目前, 单子叶植物诱导愈伤组织, 虽然可以实现农杆菌对某些禾本科植物的遗传转化, 但整个遗传体系的建立需要花费较长时间, 且往往只针对某一特定品种。本研究对川草2号幼穗愈伤进行农杆菌侵染和基因枪转化, 结果表明, 尽管川草2号幼穗的愈伤可以分化, 但并不能被农杆菌侵染(图5A-D)。基因枪转化实验中, 本研究采取常规高渗和滤纸干燥2种预处理方式。结果表明滤纸干燥处理转化效率高于高渗处理(图7)。用滤纸干燥预处理的转化效率与愈伤状态有较大关系, 25天幼穗愈伤的转化效率高于35天的幼穗(图7)。

本文的其它图/表

• 图1 PANIC6A (A)、PANIC6D (B)和PANIC6E (C) T-DNA区段
  LB: T-DNA区段左边界; OsAct1: 水稻启动子; hph/bar: 筛选标记基因; PvUbi1: 柳枝稷启动子; pporRFP/GUSplus: 红色荧光/葡萄糖苷酸酶报告基因; ZmUbi1: 玉米启动子; Cm^r: 氯霉素抗性基因; ccdB: 目的基因; RB: T-DNA区段右边界
  
• 表1 4种农杆菌侵染方案
  
• 图2 不同外植体诱导出愈伤后约30天的显微图
  (A)-(E) 分别表示用种子(成熟胚)、根、下胚轴、茎和幼穗诱导出的愈伤。Bars=50 μm
  
• 图3 川草2号老芒麦不同外植体愈伤诱导所用时间及诱导率
  误差线为标准误(SE), 样本容量为60。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
  
• 图4 川草2号老芒麦组培再生体系建立及幼穗愈伤分化效率随继代时间的变化
  (A) 幼穗接种于愈伤诱导培养基; (B) 幼穗诱导35天后的愈伤; (C) 挑选图(B)中结构致密坚硬的愈伤置于继代培养基15天; (D) 图(C)愈伤置于分化培养基约35天; (E) 图(D)中红色框内愈伤分化显微图; (F) 图(D)中分化苗置于生根培养基约30天; (G) 种子接种于愈伤诱导培养基; (H) 种子诱导35天后的愈伤; (I) 挑选图(H)中结构致密坚硬的愈伤置于继代培养基15天; (J) 图(I)愈伤置于分化培养基约35天; (K) 图(J)中红色框内愈伤分化显微图; (L) 不同再生时间下的幼穗愈伤分化效率(误差线为标准误, 样本容量为30, 不同小写字母表示差异显著(P<0.05))。(D), (F), (G), (J) Bars=2 cm; (A)-(C), (E), (H), (I), (K) Bars=1 cm
  
• 图5 根癌农杆菌侵染川草2号老芒麦幼穗和幼穗愈伤
  (A), (B) 农杆菌侵染幼穗愈伤GUS染色前后图片; (C), (D) 农杆菌侵染幼穗愈伤RFP荧光下明场和暗场图片; (E), (F) 农杆菌直接侵染幼穗后GUS染色前后图片; (G), (H) 农杆菌直接侵染幼穗后RFP下明场和暗场图片。Bars=50 μm
  
• 图6 不同诱导时间和预处理方式下的幼穗愈伤基因枪轰击后的荧光显微图
  (A), (B) 25天幼穗愈伤(未进行轰击); (C), (D) 25天幼穗愈伤常规高渗处理; (E), (F) 25天幼穗愈伤滤纸干燥处理2小时; (G), (H) 35天的幼穗愈伤滤纸干燥处理2小时。箭头所示为阳性转化愈伤。Bars=20 μm