硝酸盐转运蛋白NRT2在植物中的功能及分子机制研究进展 植物学报    2023, 58 (5): 783-798.   DOI: 10.11983/CBB22134

表1 拟南芥、水稻和玉米中NRT2成员的研究汇总

正文中引用本图/表的段落

迄今为止, 在拟南芥中共鉴定到7个NRT2家族成员, 其中AtNRT2.1、AtNRT2.2、AtNRT2.4和AtNRT2.5属于高亲和硝酸盐转运系统(Orsel et al., 2002; Wang et al., 2018) (表1)。根系是植物吸收营养物质的主要器官, AtNRT2家族中的AtNRT2.1、AtNRT2.2、AtNRT2.4和AtNRT2.5均在根中表达。研究发现, 在1 mmol?L-1 NO₃-处理下, 相较于AtNRT2.1和AtNRT- 2.2受到NO₃-强烈诱导, AtNRT2.4在根中只有少量诱导, AtNRT2.5的表达则被NO₃-强烈抑制(Okamoto et al., 2003)。在严重氮饥饿条件下, AtNRT2.4被大量诱导表达, 一旦外源供给氮素, 其表达水平会迅速下降(Okamoto et al., 2003; Kiba et al., 2012)。基于NO₃-吸收的生理及表型实验证明, AtNRT2.1和AtNRT2.2在iHATS系统中发挥关键作用(Orsel et al., 2004)。进一步的遗传学实验表明, AtNRT2.1在iHATS中占主导作用, AtNRT2.2则起辅助吸收作用。在Atnrt2.1/ Atnrt2.2双突变体中回补AtNRT2.1, 其NO₃-吸收恢复至野生型水平, 而当AtNRT2.1缺失后, 回补AtNRT- 2.2只能部分补偿植株的生长缺陷(Li et al., 2007)。与AtNRT2.1和AtNRT2.2不同, AtNRT2.4和AtNRT2.5只有在极低浓度的NO₃-或严重氮饥饿条件下行使功能。在爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞中的实验结果显示, AtNRT2.4属于高亲和硝酸根转运蛋白, Atnrt2.4突变体在氮匮乏条件下氮吸收减少且地上部的氮含量也明显下降, 在AtNRT2.1及AtNRT2.2双突变的基础上突变AtNRT2.4 (三重突变体)后, 因根部硝酸根内流的减少对低氮下地上部的生物量产生更显著的影响(Kiba et al., 2012)。AtNRT2.5的表达同样受到氮饥饿诱导, 在长期遭受氮胁迫处理时, AtNRT2.5在拟南芥地上部及地下部根系中均被诱导表达(Lezhneva et al., 2014)。AtNRT2.4和AtNRT2.5还在茎的维管组织中表达, 其编码蛋白介导韧皮部NO₃-的装载(Kiba et al., 2012; Lezhneva et al., 2014), 这表明AtNRT2.4和AtNRT2.5虽与AtNRT2.1及AtNRT2.2一样也介导根部的硝酸根吸收, 但其也参与硝酸根自根部向地上各组织的转运, 而且AtNRT2.5可能更多是在遭受氮饥饿的成年材料中发挥作用。

随着反向遗传学的发展, 在水稻中也鉴定到了具有保守高亲和硝酸盐转运功能的NRT2 (表1)。目前已鉴定到4个NRT2基因(OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.3和OsNRT2.4), 其中OsNRT2.3因选择性剪接产生了OsNRT2.3a (也被命名为OsNRT2.5)和OsNRT2.3b两个转录本(Feng et al., 2011)。根中OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.3a和OsNRT2.4的表达受到NO₃-诱导, OsNRT2.3b的表达则对NO₃-不敏感(Feng et al., 2011)。与拟南芥相似, 水稻中的OsNRT2.1和OsNRT2.2对NO₃-的亲和力高于OsNRT2.3和OsNRT2.4 (Yan et al., 2011)。同样的, 水稻OsNRT2.1、OsNRT2.2及OsNRT2.3a与OsNAR2.1的相互作用对其各自发挥硝酸根转运蛋白活力, 吸收转运NO₃-也是必需的(Yan et al., 2011; Feng et al., 2011; Liu et al., 2014)。

NRT2家族成员在水稻中的功能研究也取得了一系列进展。研究表明, 过表达OsNRT2.1使得水稻种子根、不定根和侧根总长度增加, 且在OsNRT2.1过表达植株中生长素转运蛋白基因OsPIN1a/b/c和OsPIN2的表达量也显著升高, 暗示OsNRT2.1可能通过调控生长素向根系的转运参与硝酸盐依赖的根系伸长过程(Naz et al., 2019), 但过量表达OsNRT- 2.1并未增加NO₃-的吸收速率(Katayama et al., 2009)。在水稻中利用Ubiquitin启动子过表达OsNRT2.1, 尽管总分蘖数、生物量及总含氮量均显著提高, 但由于缺少伴侣蛋白OsNAR2.1的同步提高, 最终导致其由茎秆及叶向穗中的氮转运效率明显下降, 从而导致单株产量显著降低(陈景光等, 2016; Chen et al., 2016a), 这与Katayama等(2009)的报道相似, 也再次证明OsNRT2.1与其伴侣蛋白OsNAR2.1的结合对其发挥吸收硝酸盐功能的重要性(Feng et al., 2011)。有意思的是, 当以OsNAR2.1的启动子驱动OsNRT2.1 (pOsNAR2.1:OsNRT2.1)在水稻中过量表达时, 能显著促进转基因株系的生长, 提高氮素吸收效率及籽粒产量, 其农学氮素利用效率(agricultural nitrogen- use efficiency, ANUE)是野生型的128% (Chen et al., 2016a; 陈景光, 2017)。

在禾本科作物玉米中, 目前已鉴定到ZmNRT2.1、Zm- NRT2.2、ZmNRT2.3和ZmNRT2.5共4个NRT2家族的硝酸根转运蛋白(Plett et al., 2010) (表1)。该家族中只有ZmNRT2.1和ZmNRT2.2两个基因亲缘关系较近, 氨基酸序列同源性达98%。ZmNRT2.1和ZmNRT2.2的转录水平在根部均受NO₃-诱导, 原位杂交结果表明ZmNRT2.1特异性在皮层表达, 而ZmNRT2.2除分布于皮层, 还在中柱和侧根原基中表达(Trevisan et al., 2008), 并且玉米根系对NO₃-吸收能力的增强与ZmNRT2.1和ZmNRT2.2转录水平的快速上调相对应(Sabermanesh et al., 2017)。ZmNRT2.5的表达仅在氮饥饿和低氮条件下被检测到, 并且受到氮饥饿(无氮)的强烈诱导, 在植株重新补充氮(2.5 mmol?L-1 NH₄NO₃)后, 根和茎中ZmNRT2.5的表达量均下调(Dechorgnat et al., 2019); 当玉米进入生殖生长期, ZmNRT2.5在根中的表达趋近于零, 反而在苞叶中表达量较高, 推测ZmNRT2.5可能在灌浆期籽粒氮分配中起重要作用(Fujita et al., 1995)。迄今为止, 关于ZmNRT2家族成员的相关研究基本都在转录水平, 还未见生理及遗传学实验验证ZmNRT2的NO₃-转运活性以及亲和力。

近年来, 研究人员陆续鉴定到多个转录因子参与调控NRT2.1。其中, 负调控因子NIGT1 (NITRATE- INDUCIBLE GARP-type TRANSCRIPTIONAL REPRESSOR 1)是一类由NO₃-诱导的转录抑制子。研究表明NIGT1.1可以在低氮胁迫下抑制NLP7驱动的AtNRT2.1表达的激活, 且通过凝胶迁移(EMSA)实验证明NIGT1.1可以直接结合AtNRT2.1的启动子区; 此外, 共转染实验结果显示, 与NIGT1.1属于同一支系的同源基因(包括NIGT1.2、NIGT1.3和NIGT1.4)均受NO₃-诱导, 并且在抑制硝酸盐依赖的AtNRT2.1表达激活中存在功能冗余(Maeda et al., 2018)。值得注意的是, 磷饥饿反应的主调控因子PHR1 (PHOSPHATE STARVATION RESPONSE 1)可以直接激活NIGT1s基因的表达, 导致硝酸盐的摄取减少(Maeda et al., 2018), 表明磷饥饿可能通过PHR1- NIGT1-NRT2.1的转录级联影响硝酸根的吸收。相反, 属于bZIP (BASIC REGION/LEUCINE ZIPPER)转录因子家族的TGA1 (TGACG MOTIF-BINDING FACTOR 1)和TGA4则对NRT2家族基因发挥正向调控作用(Alvarez et al., 2014)。在tag1/4双突变体中, NO₃-诱导的AtNRT2.1和AtNRT2.2基因表达量显著降低; 同时, 在原生质体中过表达TGA1或TGA4, AtNRT2.1和AtNRT2.2基因的表达量明显高于对照组, 表明TGA1和TGA4正向调控AtNRT2.1和AtNRT2.2的表达(Alvarez et al., 2014)。进一步通过ChIP和酵母单杂交实验证明, TGA1可以直接结合AtNRT2.1和AtNRT2.2的启动子区(Alvarez et al., 2014)。反向遗传学研究证明, 侧生器官边界结构域蛋白LBD37/ 38/39也是调控硝酸盐应答反应中重要的转录因子, 并受NO₃-强烈诱导。LBD37/38/39的过表达可以抑制AtNRT2.1、AtNRT2.2以及氮同化相关基因的表达, 表明LBD的这3个成员在硝酸盐信号转导中起负调控作用(Rubin et al., 2009), 但是目前尚未证实LBD是否能够直接靶向调控NRT2家族成员的表达。

NRT2.1除了在初级硝酸盐反应中受上述转录因子的调控, 在硝酸盐介导的系统性信号通路中, NRT2.1可能作为潜在的调控枢纽。研究表明, 拟南芥转录因子TCP20 (TEOSINATE BRANCHED 1/CYC-LOIDEA/ PROLIFERATING CELL FACTOR 20)调控低硝酸盐条件下拟南芥根部觅食的系统信号转导, 体内和体外的研究结果显示TCP20可以与AtNRT2.1、AtNRT1.1以及AtNIA1 (NITRATE REDUCTASE NADH 1, NIA1)的启动子区直接结合(Guan et al., 2014)。然而, 在5 mmol?L-1 KNO₃培养基上生长10天后分别检测野生型和tcp20突变体中AtNRT2.1、AtNRT1.1和AtNIA1的表达, 发现突变体中的AtNRT1.1和AtNIA1表达水平显著下降, 但是AtNRT2.1的表达量与野生型(WT)无明显差异; 通过分根实验也证实无论低氮(0 mmol?L-1 KNO₃)还是高氮(5 mmol?L-1 KNO₃), AtNRT2.1的表达量不受TCP20突变的影响(Guan et al., 2014)。因此, TCP20与AtNRT2.1的遗传学关系和转录调控机制还需深入研究。

与其它NRT2定位于质膜不同, AtNRT2.7定位于液泡膜, 在干种子中的表达量很高, 并介导种子中NO₃-的积累(Chopin et al., 2007).目前, 关于AtNRT2.3的功能还未见报道, 仅停留在不同组织及低浓度硝酸盐诱导的表达模式分析上, AtNRT2.3在根部的表达基本不受硝酸盐影响, 而且AtNRT2.3在不同营养生长期的拟南芥材料中具有差异化组织表达特征(Okamoto et al., 2003), 这在一定程度上暗示AtNRT2.3具有特殊功能.虽然AtNRT2.6未被检测到能够转运NO₃-, 但是AtNRT2.6可能也与AtNRT2.1一样需要在伴侣蛋白的帮助下才具备硝酸根转运活性(Dechorgnat et al., 2012).有意思的是, AtNRT2.6的转录受到高浓度硝酸盐和病原菌梨火疫病菌(Erwinia amylovora)的显著诱导, 并且其表达与活性氧(reactive oxygen species, ROS)的积累存在正相关, 由此也导致AtNRT2.6缺失突变体Atnrt2.6中活性氧含量减少, 同时表现出对梨火疫病菌的攻击更加敏感, 暗示AtNRT2.6可能介导植物对病原菌侵染的响应过程, 但其通过转运硝酸根还是其它分子介导该过程尚不清楚(Dechorgnat et al., 2012). ...