小桐子半胱氨酸蛋白酶家族和相应miRNAs的鉴定及其对低温锻炼的响应 植物学报    2021, 56 (5): 544-558.   DOI: 10.11983/CBB21014

表1 qRT-PCR相关引物

正文中引用本图/表的段落

利用小桐子数据库(http://jcdb.xtbg.ac.cn/)中公开的 RNA-seq数据进行数字表达谱分析(Zhang et al., 2019), 其中包括小桐子植株在不同组织/器官的表达信息。本研究采用的小桐子低温锻炼过程的转录组、miRNA组和降解组数据来自本实验室测序数据, 登录号见1.3节。

为验证半胱氨酸蛋白酶基因与靶向miRNAs的互作关系, 我们挑选小桐子半胱氨酸蛋白酶家族3个基因及相关的miRNAs进行qRT-PCR分析, 根据基因序列设计特异性定量引物(表1), 使用Trizol试剂从冷冻叶片中提取总RNA, 用反转录试剂盒PrimerScript RT Reagent Kit with gDNA Erase (Takara, 大连)将RNA反转录成cDNA, 保存于-80°C冰箱, 备用。

基于小桐子数据库中公开的RNA-seq数据, 对半胱氨酸蛋白酶基因家族在小桐子不同器官中的表达量进行数字表达谱分析。结果表明, 小桐子半胱氨酸蛋白酶家族基因在花蕾、种子、茎端和叶片中均有表达(图5), 其中, JcRD21B、JcRD19A、JcBVPE2、JcRD21C、JcCEP1、JcRD21A、JcUCH2、JcCTB1、JcRD19C和JcAMC1F这10个基因在花、种子、茎端和叶片中表达丰度较高, 而JcAMC1H、JcXBCP3L、JcAMC3B、JcDEK1、JcBVPE3、JcSAG12H、JcAMC1E、JcSAG12H1、JcRD19B、JcXCP1、JcSAG12H7、JcALP1、JcPCP1、JcPCP2、JcSAG12H6、JcAMC9A、JcSAG12H4、JcXCP2、JcAMC1C、JcSAG12H3和JcAMC2D在花、种子、茎端和叶片中的表达丰度相对较低。

前期研究表明, 12°C低温锻炼48小时可显著增强小桐子在1°C下的耐冷性(Ao et al., 2013a, 2013b)。利用本实验室测序获得的小桐子在低温锻炼过程中的转录组数据(PRJNA661688), 对半胱氨酸蛋白酶家族基因的表达谱进行分析(图6)。结果表明, 该家族大部分成员在12°C低温锻炼期间均明显上调表达, 其中JcAMC1H在6小时表达量最高; 而JcCEP2、JcSAG12H7和JcSAG12H4在低温锻炼前期呈下调表达趋势。

本研究在基因组层面上对小桐子半胱氨酸蛋白酶全基因家族进行了生物信息学分析, 共鉴定到39个家族成员, 可分为C1A、C2、C12、C13、C14和C15共6个亚家族, 定位于11条染色体上, 部分基因之间发生了片段重复, 如JcRD21A和JcRD21A1, JcSAG12H6和JcSAG12H7; 而JcSAG12H5和JcSAG12H4、JcSAG12H3和JcSAG12H4、JcSAG12H5和JcSAG12H3之间的氨基酸同源性达90%以上, 位于不同染色体之间, 推测可能是发生了染色体异位重复(图1, 图4)。蛋白结构域分析结果表明, 小桐子半胱氨酸蛋白酶家族均具有共同的Cys和His活性位点, 保守基序结构域前体序列为ExxxRxxxxxxN/ VxxxNx (图2, 图3)。基于RNA-seq的研究结果表明, 小桐子半胱氨酸蛋白酶基因家族的39个成员在植株的不同组织/器官及在低温锻炼过程中均呈现空间和时间的差异化表达(图5, 图6)。Zou等(2018)研究表明, C1A家族大部分成员在小桐子叶片中表达量较高, 根据本研究结果及与其它5个亚家族成员进行横向比较, 我们发现在种子、花蕾、茎端和叶片中表达量占比较大的基本是C1A亚家族成员, 表明该基因家族不同成员的表达水平在小桐子生长发育的不同阶段及对不同外界环境刺激过程中存在差异化响应。这些结果对我们深入理解小桐子半胱氨酸蛋白酶家族各成员在生长发育过程和对环境变化响应中的作用具有参考价值。

本文的其它图/表

• 表2 小桐子中已鉴定的半胱氨酸蛋白酶的理化性质
  
• 图1 小桐子、水稻和蓖麻半胱氨酸蛋白酶家族的系统发育进化树
  
• 图2 小桐子6个半胱氨酸蛋白酶亚家族的蛋白结构
  C: 半胱氨酸; D: 天冬氨酸; E: 谷氨酸; H: 组氨酸; N: 天冬酰胺; Q: 谷氨酰胺
  
• 图3 使用MEME软件确定的小桐子半胱氨酸蛋白酶家族9个重要的基序
  横坐标表示基序的长度; 纵坐标表示基序的保守程度。
  
• 图4 小桐子半胱氨酸蛋白酶基因染色体定位及成对发生的重复事件
  重复基因对用线显示和连接。
  
• 图5 小桐子半胱氨酸蛋白酶家族基因在不同器官中的表达热图
  
• 图6 小桐子幼苗叶片半胱氨酸蛋白酶家族基因在12°C低温锻炼期间基因表达的热图
  
• 图7 miRNAs靶向调控小桐子半胱氨酸蛋白酶家族基因的网络图
  红色代表半胱氨酸蛋白酶基因, 蓝色代表miRNAs。
  
• 图8 靶向调控小桐子半胱氨酸蛋白酶家族基因的miRNAs在12°C低温锻炼期间的热图
  
• 图9 小桐子幼苗在12°C低温锻炼期间半胱氨酸蛋白酶基因JcDEK1、JcRD21B、JcXBCP3L以及靶向这些基因miRNAs的qRT-PCR共表达分析
  *与**分别表示不同时间的表达量与对照0小时在P<0.05与P<0.01水平差异显著。