植物学报 ›› 2020, Vol. 55 ›› Issue (1): 62-68.DOI: 10.11983/CBB19143 cstr: 32102.14.CBB19143
徐重益(
)
首页收稿日期:2019-08-01
接受日期:2019-08-30
出版日期:2020-01-01
发布日期:2019-12-20
通讯作者:
徐重益
基金资助:
Chongyi Xu()
Received:2019-08-01
Accepted:2019-08-30
Online:2020-01-01
Published:2019-12-20
Contact:
Chongyi Xu
摘要： 蛋白互作在细胞生命活动中发挥关键作用, 在不同时空层面上参与多种细胞学过程, 因此研究蛋白互作对理解分子调控网络至关重要。通常情况下, 利用酵母双杂交系统筛选植物蛋白互作必须通过体外和体内系统进行验证。Pull-down和Co-IP是验证植物蛋白互作的常用技术。Pull-down被广泛用于体外验证蛋白间的直接互作; 而在植物活体内, 利用本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达蛋白, 继而通过Co-IP进行鉴定是目前验证蛋白互作最简单且最有效的方法之一。该文对GST Pull-down和烟草瞬时表达系统中Co-IP技术原理及实验方案进行详细描述, 以期为验证植物蛋白互作提供参考。
徐重益. 植物中验证蛋白相互作用的Pull-down和Co-IP技术. 植物学报, 2020, 55(1): 62-68.
Chongyi Xu. Pull-down and Co-immunoprecipitation Assays of Interacting Proteins in Plants. Chinese Bulletin of Botany, 2020, 55(1): 62-68.
| Solution | Composition | Final concentration |
|---|---|---|
| 1× PBS buffer (pH7.4) | NaCl KCl | 137 mmol·L-1 2.7 mmol·L-1 |
| Na2HPO4 | 10 mmol·L-1 | |
| KH2PO4 | 2 mmol·L-1 | |
| NETN buffer | Tris-HCl (pH8.0) | 20 mmol·L-1 |
| NaCl | 100 mmol·L-1 | |
| EDTA | 0.5 mmol·L-1 | |
| Nonidet P-40 (NP-40) | 0.5% (v/v) | |
| 3× SDS sam- ple buffer | Tris-HCl (pH6.8) Glycerin | 167 mmol·L-1 33% (v/v) |
| Sodium dodecyl sulfate | 6.6% (w/v) | |
| Bromophenol blue | 0.01% (w/v) | |
| β-mercaptoethanol | 7.5% (v/v) |
表1 GST Pull-down实验流程中所使用的相关试剂配方
Table 1 Related reagent formulations used in the GST Pull- down
| Solution | Composition | Final concentration |
|---|---|---|
| 1× PBS buffer (pH7.4) | NaCl KCl | 137 mmol·L-1 2.7 mmol·L-1 |
| Na2HPO4 | 10 mmol·L-1 | |
| KH2PO4 | 2 mmol·L-1 | |
| NETN buffer | Tris-HCl (pH8.0) | 20 mmol·L-1 |
| NaCl | 100 mmol·L-1 | |
| EDTA | 0.5 mmol·L-1 | |
| Nonidet P-40 (NP-40) | 0.5% (v/v) | |
| 3× SDS sam- ple buffer | Tris-HCl (pH6.8) Glycerin | 167 mmol·L-1 33% (v/v) |
| Sodium dodecyl sulfate | 6.6% (w/v) | |
| Bromophenol blue | 0.01% (w/v) | |
| β-mercaptoethanol | 7.5% (v/v) |
| Solution | Composition | Final concentration |
|---|---|---|
| Infiltration buffer | MES-KOH (pH5.6) | 10 mmol·L-1 |
| MgCl2 | 10 mmol·L-1 | |
| Acetyl syringone (AS) | 0.2 mmol·L-1 | |
| NB1 buffer | Tris-MES (pH8.0) | 50 mmol·L-1 |
| Sucrose | 500 mmol·L-1 | |
| MgCl2 | 1 mmol·L-1 | |
| EDTA | 10 mmol·L-1 | |
| DTT | 5 mmol·L-1 | |
| PMSF | 1 mmol·L-1 | |
| Cocktail | 100× | |
| 3× SDS sample buffer | Same as Pull-down |
表2 Co-IP实验流程中所使用的相关试剂配方
Table 2 Related reagent formulations used in the Co-IP
| Solution | Composition | Final concentration |
|---|---|---|
| Infiltration buffer | MES-KOH (pH5.6) | 10 mmol·L-1 |
| MgCl2 | 10 mmol·L-1 | |
| Acetyl syringone (AS) | 0.2 mmol·L-1 | |
| NB1 buffer | Tris-MES (pH8.0) | 50 mmol·L-1 |
| Sucrose | 500 mmol·L-1 | |
| MgCl2 | 1 mmol·L-1 | |
| EDTA | 10 mmol·L-1 | |
| DTT | 5 mmol·L-1 | |
| PMSF | 1 mmol·L-1 | |
| Cocktail | 100× | |
| 3× SDS sample buffer | Same as Pull-down |
图1 利用原核表达系统检测融合GST ( 谷胱甘肽-S-转移酶)的诱饵蛋白与捕获蛋白互作的Pull-down实验流程图 IPTG: 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷; GSH: 谷胱甘肽
Figure 1 Schematic representation of the Pull-down procedure in prokaryotic expression system to test the interaction between a bait protein tagged with GST (glutathione S-transferase) and a prey protein IPTG: Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside; GSH: Glutathione
图2 利用烟草瞬时转化体系检测融合Myc的诱饵蛋白与融合Flag的捕获蛋白互作的Co-IP实验流程图
Figure 2 Schematic representation of the Co-immunoprecipitation procedure from infiltrated Nicotiana benthamiana leaves to test the interaction between a prey protein tagged with Flag and a bait protein tagged with Myc
| [1] | Fernández-Bautista N, Fernández-Calvino L, Muñoz A, Castellano MM (2017). HOP3, a member of the HOP family in Arabidopsis, interacts with BiP and plays a major role in the ER stress response. Plant Cell Environ 40, 1341-1355. |
| [2] | Hirsch S, Kim J, Muñoz A, Heckmann AB, Downie JA, Oldroyd GED (2009). GRAS proteins form a DNA binding complex to induce gene expression during nodulation signaling in Medicago truncatula. Plant Cell 21, 545-557. |
| [3] | Muñoz A, Mangano S, González-García MP, Contreras R, Sauer M, De Rybel B, Weijers D, Sánchez-Serrano JJ, Sanmartin M, Rojo E (2017). RIMA-dependent nuclear accumulation of IYO triggers auxin-irreversible cell differentiation in Arabidopsis. Plant Cell 29, 575-588. |
| [4] | Smith DB, Johnson KS (1988). Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene 67, 31-40. |
| [5] | Stasi M, De Luca M, Bucci C (2015). Two-hybrid-based systems: powerful tools for investigation of membrane traffic machineries. J Biotechnol 202, 105-117. |
| [6] | Takahashi Y (2015). Co-immunoprecipitation from transfected cells. In: Meyerkord CL, Fu HA, eds. Protein-Protein Interactions. York: Humana Press.pp. 381-389. |
| [7] | Wissmueller S, Font J, Liew CW, Cram E, Schroeder T, Turner J, Crossley M, Mackay JP, Matthews JM (2011). Protein-protein interactions: analysis of a false positive GST pulldown result. Proteins 79, 2365-2371. |
| [1] | 肖治术, 范宗骥, 于桂清, 范明亮. 油麻藤属(Mucuna)植物的传粉和种子传播研究进展: 现状与展望[J]. , 2027, 51(动植物互作): 0-. |
| [2] | 刘志祥, 黎凤兰, 黄晓磊. 昆虫虫瘿生态系统的复杂性及成瘿机制研究进展[J]. , 2027, 51(动植物互作): 0-. |
| [3] | 曹伊菲, 苏涛, 曹敏, 汪海燕, 杨洁. 新生代被子植物叶脉密度演化的驱动因素研究：气候适应与植食压力[J]. , 2027, 51(动植物互作): 0-. |
| [4] | 何青, 袁旭东, 任博申, 冯治洋, 鲁梦珍, 林巧玲, 姜庆虎, 杨林森, 余辉亮, 姚辉, 杨敬元, 刘峰, 江明喜. 一年蓬（Erigeron annuus）入侵对亚高山泥炭湿地植物群落结构与多样性的影响[J]. 植物生态学报, 2026, 50(预发表): 0-. |
| [5] | 陈欣蕊, 宋维峰, 王燚, 王浩, 孙诗瑶, 王彩江, 蔡世鹏, 任红, 何玉陶, 潘珉, 曹光秀, 严毅, 谢志勇, 王行. 滇池湖滨带典型挺水植物氮磷重吸收特征及其适应策略[J]. , 2026, 50(预发表): 0-. |
| [6] | 柯嘉雯, 程张浩, 高雪夷, 徐云剑, 王毅. 镉污染下的植物响应：从吸收、转运到应答与缓解机制[J]. 植物生态学报, 2026, 50(预发表): 1-. |
| [7] | 赵掷艺, 黄伟权, 胡婧妍, 王义越, 虞梦婕, 吴玉环. 泥炭沼泽湿地植物残体分解及微生物作用机理研究进展[J]. , 2026, 50(预发表): 0-. |
| [8] | 胡光明, 欧旭, 龙文兴. 热带云雾林宿主树皮粗糙度对附生维管植物多样性与孢子定殖的影响[J]. 植物生态学报, 2026, 50(预发表): 1-. |
| [9] | 段建林, 孟晟, 陈仁利, 熊林峰, 卢春洋, 席念勋. 全球变化因子多样性对菌根植物性状的影响[J]. , 2026, 50(预发表): 0-. |
| [10] | 杨梅花, 张子嘉, 乔栋, 冯俊娜, 庞子杰, 钱龙, 刘志晖, 蔡娜娜, 胡中民, 杨国姣. 海南热带森林乔木群落调查和多样性数据集[J]. 植物生态学报, 2026, 50(预发表): 0-. |
| [11] | 郝晨阳, 高少羽, 程跃华, 扎西尼玛, 徐波, 杨扬. 横断山区高山冰缘植物毡毛雪莲紧实深色头状花序的生态功能[J]. 生物多样性, 2026, 34(5): 25489-. |
| [12] | 郭蓉, 吴旭东, 张雨, 康瑞红, 王一凡, 王占军, 蒋齐, 俞鸿千, 马琨. 荒漠草原土壤丛枝菌根真菌群落对降水变化的响应[J]. 生物多样性, 2026, 34(5): 26028-. |
| [13] | 尹翔正, 姜海燕, 张俊, 罗春生, 张元明. 极端干旱区荒漠灌木叶际细菌群落多样性特征[J]. 生物多样性, 2026, 34(4): 25485-. |
| [14] | 李劲, 程铭昊, 张溢, 刘峰, 姜庆虎, 叶基荣, 陈展, 张于光. 不同海拔巴山冷杉林土壤微生物多样性及植物-微生物跨界生态网络关系[J]. 生物多样性, 2026, 34(4): 25276-. |
| [15] | 赵慧, 杨晓瑞, 韩洁, 陈四龙. 基于AI的植物生物学课程知识图谱建设与应用[J]. 植物学报, 2026, 61(4): 1-0. |
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