植物学报 ›› 2020, Vol. 55 ›› Issue (1): 62-68.DOI: 10.11983/CBB19143 cstr: 32102.14.CBB19143
徐重益(
)
首页收稿日期:2019-08-01
接受日期:2019-08-30
出版日期:2020-01-01
发布日期:2019-12-20
通讯作者:
徐重益
基金资助:
Chongyi Xu()
Received:2019-08-01
Accepted:2019-08-30
Online:2020-01-01
Published:2019-12-20
Contact:
Chongyi Xu
摘要： 蛋白互作在细胞生命活动中发挥关键作用, 在不同时空层面上参与多种细胞学过程, 因此研究蛋白互作对理解分子调控网络至关重要。通常情况下, 利用酵母双杂交系统筛选植物蛋白互作必须通过体外和体内系统进行验证。Pull-down和Co-IP是验证植物蛋白互作的常用技术。Pull-down被广泛用于体外验证蛋白间的直接互作; 而在植物活体内, 利用本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达蛋白, 继而通过Co-IP进行鉴定是目前验证蛋白互作最简单且最有效的方法之一。该文对GST Pull-down和烟草瞬时表达系统中Co-IP技术原理及实验方案进行详细描述, 以期为验证植物蛋白互作提供参考。
徐重益. 植物中验证蛋白相互作用的Pull-down和Co-IP技术. 植物学报, 2020, 55(1): 62-68.
Chongyi Xu. Pull-down and Co-immunoprecipitation Assays of Interacting Proteins in Plants. Chinese Bulletin of Botany, 2020, 55(1): 62-68.
| Solution | Composition | Final concentration |
|---|---|---|
| 1× PBS buffer (pH7.4) | NaCl KCl | 137 mmol·L-1 2.7 mmol·L-1 |
| Na2HPO4 | 10 mmol·L-1 | |
| KH2PO4 | 2 mmol·L-1 | |
| NETN buffer | Tris-HCl (pH8.0) | 20 mmol·L-1 |
| NaCl | 100 mmol·L-1 | |
| EDTA | 0.5 mmol·L-1 | |
| Nonidet P-40 (NP-40) | 0.5% (v/v) | |
| 3× SDS sam- ple buffer | Tris-HCl (pH6.8) Glycerin | 167 mmol·L-1 33% (v/v) |
| Sodium dodecyl sulfate | 6.6% (w/v) | |
| Bromophenol blue | 0.01% (w/v) | |
| β-mercaptoethanol | 7.5% (v/v) |
表1 GST Pull-down实验流程中所使用的相关试剂配方
Table 1 Related reagent formulations used in the GST Pull- down
| Solution | Composition | Final concentration |
|---|---|---|
| 1× PBS buffer (pH7.4) | NaCl KCl | 137 mmol·L-1 2.7 mmol·L-1 |
| Na2HPO4 | 10 mmol·L-1 | |
| KH2PO4 | 2 mmol·L-1 | |
| NETN buffer | Tris-HCl (pH8.0) | 20 mmol·L-1 |
| NaCl | 100 mmol·L-1 | |
| EDTA | 0.5 mmol·L-1 | |
| Nonidet P-40 (NP-40) | 0.5% (v/v) | |
| 3× SDS sam- ple buffer | Tris-HCl (pH6.8) Glycerin | 167 mmol·L-1 33% (v/v) |
| Sodium dodecyl sulfate | 6.6% (w/v) | |
| Bromophenol blue | 0.01% (w/v) | |
| β-mercaptoethanol | 7.5% (v/v) |
| Solution | Composition | Final concentration |
|---|---|---|
| Infiltration buffer | MES-KOH (pH5.6) | 10 mmol·L-1 |
| MgCl2 | 10 mmol·L-1 | |
| Acetyl syringone (AS) | 0.2 mmol·L-1 | |
| NB1 buffer | Tris-MES (pH8.0) | 50 mmol·L-1 |
| Sucrose | 500 mmol·L-1 | |
| MgCl2 | 1 mmol·L-1 | |
| EDTA | 10 mmol·L-1 | |
| DTT | 5 mmol·L-1 | |
| PMSF | 1 mmol·L-1 | |
| Cocktail | 100× | |
| 3× SDS sample buffer | Same as Pull-down |
表2 Co-IP实验流程中所使用的相关试剂配方
Table 2 Related reagent formulations used in the Co-IP
| Solution | Composition | Final concentration |
|---|---|---|
| Infiltration buffer | MES-KOH (pH5.6) | 10 mmol·L-1 |
| MgCl2 | 10 mmol·L-1 | |
| Acetyl syringone (AS) | 0.2 mmol·L-1 | |
| NB1 buffer | Tris-MES (pH8.0) | 50 mmol·L-1 |
| Sucrose | 500 mmol·L-1 | |
| MgCl2 | 1 mmol·L-1 | |
| EDTA | 10 mmol·L-1 | |
| DTT | 5 mmol·L-1 | |
| PMSF | 1 mmol·L-1 | |
| Cocktail | 100× | |
| 3× SDS sample buffer | Same as Pull-down |
图1 利用原核表达系统检测融合GST ( 谷胱甘肽-S-转移酶)的诱饵蛋白与捕获蛋白互作的Pull-down实验流程图 IPTG: 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷; GSH: 谷胱甘肽
Figure 1 Schematic representation of the Pull-down procedure in prokaryotic expression system to test the interaction between a bait protein tagged with GST (glutathione S-transferase) and a prey protein IPTG: Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside; GSH: Glutathione
图2 利用烟草瞬时转化体系检测融合Myc的诱饵蛋白与融合Flag的捕获蛋白互作的Co-IP实验流程图
Figure 2 Schematic representation of the Co-immunoprecipitation procedure from infiltrated Nicotiana benthamiana leaves to test the interaction between a prey protein tagged with Flag and a bait protein tagged with Myc
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