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核糖体图谱技术在植物学研究中的应用
植物学报
2022, 57 (5):
673-683.
DOI: 10.11983/CBB22028
随着高通量测序技术的持续发展和进步, 开发出很多新颖的测序技术, 为诸多悬而未决的生物学难题提供了解决方案。其中, 核糖体图谱技术能够在全基因组水平和单核苷酸分辨率上监控细胞内的翻译事件, 填补了转录组学和蛋白质组学研究之间的空隙。核糖体图谱技术不仅能够鉴定处于翻译状态的RNA分子, 还能够精确定位RNA分子上正在翻译的核苷酸, 进而准确描绘RNA分子上的开放阅读框。此外, 结合转录组测序数据, 核糖体图谱技术还可以确定每个转录本上的核糖体数量, 从而计算每个转录本的翻译效率。目前, 核糖体图谱技术已成功应用于动物、植物和微生物等研究领域, 加深了人们对翻译调控机制的认识。然而, 由于植物细胞和组织的特性, 核糖体图谱技术在植物学研究中的应用仍然存在局限。该文综述了核糖体图谱技术的实验原理, 以及在植物学研究中的相关进展。  View image in article
图1
核糖体图谱实验流程示意图
(A) 在核糖体图谱技术(Ribo-seq)中, 多聚核糖体经RNA酶消化成单核糖体, 约30 nt的受核糖体保护的mRNA片段(RPFs)未被RNA酶降解; 将单核糖体解离, 并从中分离和纯化RPFs用于高通量测序, 仅mRNA的蛋白编码区有测序信号; (B) 搭配转录组测序(RNA-seq), 可计算出每条转录本的翻译效率, 在转录组测序中整个转录本上均有测序信号。5′UTR: 5′端非翻译区; 3′UTR: 3′端非翻译区; ORF: 开放阅读框
正文中引用本图/表的段落
核糖体图谱技术由RPFs富集技术和深度测序技术相结合而成。在生理条件下, 正在翻译的mRNA通常结合多个核糖体, 形成多聚核糖体(polysome) (林忠平, 1984)。多聚核糖体首先经RNA酶处理以消化未被核糖体覆盖的区域, 形成单核糖体(monosome)。随后将单核糖体解离, 从中纯化RPFs用于构建文库和深度测序, 测序结果揭示了在特定mRNA分子上核糖体印迹的位置和数量(图1)。同时, 对相同的实验样品进行转录组测序(RNA sequencing, RNA-seq), 就能够准确定量每个转录本上的核糖体数量, 从而计算该转录本的翻译效率。此外, 核糖体印迹的精确定位也能够在全基因组水平上鉴定ORF。
杂种优势表现为杂交后代在生长、产量、抗性和适应性等方面的性状优于亲本, 在农业生产上常用于培育产量更高、抗性更强的作物品种(商连光等, 2017)。多年来, 科学家提出了多个遗传模型尝试解释杂种优势, 但迄今为止仍没有一个模型能够完全揭开杂种优势的奥秘。2021年, 国内多个研究团队利用转录组、核糖体图谱和蛋白质组等多组学技术对玉米亲本B73、Mo17及其F1杂交后代进行分析, 从新的角度解析了玉米杂种优势的分子机制(Zhu et al., 2022)。转录组和翻译组(核糖体图谱)数据显示, F1杂交后代与2个亲本间主要表现为基因加性表达模式, 但翻译组中非加性表达所占的比例高于转录组。很多基因在转录组中表现为加性表达模式, 但在翻译组中转换为非加性表达模式, 且这种转换在maize1亚基因组中显著富集。此外, 与2个亲本相比, F1杂交后代的一些基因在翻译过程中改变了优势亚型, 这有助于F1杂交后代高效积累某些功能蛋白。这些优势亚型改变的基因在maize2亚基因组中显著富集, 而优势亚型保持不变的基因则在maize1亚基因组中显著富集。上述结果表明, 玉米亚基因组的翻译分化可能与杂种优势的形成有关(Zhu et al., 2022)。
在植物细胞中, 叶绿体和线粒体的基因表达调控也具有重要意义。Zoschke等(2013)利用改进后的核糖体图谱技术首次解析了玉米叶绿体基因的翻译图谱。他们从玉米叶片中富集RPFs后, 不是通过深度测序鉴定RPFs, 而是将这些RPFs与基因芯片(plastid ORFeome)进行杂交, 以此报告每个叶绿体mRNA的表达丰度和翻译状态。通过这种方法检测到atp1、atp4、ppr10和crp1等突变体中叶绿体基因表达的已知缺陷, 证实了该技术的准确性和灵敏性。此外, 该研究也有新的发现: (1) 重叠基因atpB/atpE的翻译是独立的而非偶联的; (2) 对于带有内含子的叶绿体mRNA (如atpF), 内含子剪切并不是其翻译起始的先决条件。
为了比较拟南芥和番茄2种模式植物翻译调控机制的保守性, Wu等(2019)利用核糖体图谱和转录组测序解析了番茄根尖的翻译事件。该研究鉴定到众多未注释的翻译事件, 包括已知基因的1 329个uORF和未注释基因的354个sORF, 进一步完善了番茄基因组的注释。uORF对其下游的mORF起翻译抑制作用, 而sORF可能编码信号分子。与拟南芥中的数据(Hsu et al., 2016)相比较, 除进化上保守的sORF外, 茄科植物还有近百个特有的sORF。蛋白质组学分析也证实这些未注释的uORF和sORF具备合成蛋白质的能力。因此, 与拟南芥相比, 番茄的翻译调控特性既具有保守性, 又体现出物种的特异性。
本文的其它图/表
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