水稻雄性不育突变体ms102的鉴定和基因定位 植物学报    2022, 57 (1): 42-55.   DOI: 10.11983/CBB21158

表3 水稻WT × ms102杂交F₂代表型分离比

正文中引用本图/表的段落

利用高分辨率溶解曲线(high resolution melting, HRM)分析方法(Lochlainn et al., 2011)鉴定F₂群体的基因型, 具体步骤如下: 在突变位点两侧设计PCR引物, 扩增片段约80-120 bp。PCR扩增体系: 1 μL 10× Buffer, 0.1 μL 2.5 mmol∙L-1 dNTP, 0.1 μL 10 μmol∙L-1正向引物, 0.1 μL 10 μmol∙L-1反向引物, 0.1 μL EvaGreen Dye (Li et al., 2010b), 1 μL DNA (参照CTAB法提取植株叶片DNA), 0.1 μL rTaq, 7.55 μL ddH₂O, 总体积10 μL。PCR反应程序: 94°C预变性3分钟; 94°C变性30秒, 55-58°C退火30秒, 72°C延伸10秒, 40个循环; 72°C延伸1分钟; 95°C变性2分钟; 常温下复性。PCR反应完成后, 在产物里加0.1 μL低温内标(internal temperature calibrators, 纠正孔与孔之间的温度差异, 提高检测的灵敏性), 转移到Light Scanner仪器中进行扫描分型。根据分型结果, 判断F₂群体该突变位点的基因型是否与表型共分离。本研究用于3个候选位点的HRM引物序列见表2。

通过筛选EMS诱变的水稻突变体库, 我们获得1个完全雄性不育的突变体, 命名为ms102。该突变体植株株型、分蘖数及叶色等农艺性状均与野生型(wild type, WT)无显著差异(图1A-C)。在水稻开花期, 对突变体与野生型小花进行解剖分析, 发现与野生型相比, 突变体花药细小, 雌蕊发育正常(图1D)。花粉成熟后, 野生型的花药可以正常开裂, 但突变体的花药不能正常开裂(图1E)。对成熟期的花粉进行I₂-KI染色观察, 发现突变体的花粉粒皱缩不规则, 染色表现为典败(图1F, G)。ms102突变体植株最终表现为不结实(图1H)。ms102突变体与野生型黄华占杂交的F₁代所有植株育性均正常。F₂代群体出现育性分离, 统计分析发现可育植株与不育植株的比例符合3:1的分离比(表3), 表明ms102突变体的雄性不育表型由单个核基因隐性突变造成。

通过透射电镜观察进一步比较野生型和突变体花药的超微结构, 结果发现突变体花药发育在第9-10时期绒毡层开始出现异常, 主要表现为突变体绒毡层细胞稍有膨大(图3A, B, D, E), 乌氏体比野生型小(图3B, E, G, H), 小孢子外壁比野生型薄(图3B, E, G, H); 突变体花药外壁的角质层与野生型相比无明显差异(图3C, F)。由于花粉发育与绒毡层降解有密切关系, 绒毡层降解异常通常伴随着花粉不同程度的败育。结合突变体花药发育第1-8时期均表现正常, 我们推测, 突变基因在花药发育的第9-10时期对雄性发育起关键调控作用。

由于S3候选位点与ms102雄性不育表型紧密连锁, 我们推测控制雄性不育的基因可能在S3候选位点附近。基因组序列分析表明, S3位点下游约91 kb处存在一个已报道的雄性不育基因DPW2 (LOC_Os01g70025)。据Xu等(2017)报道, dpw2突变体的花药瘦小且为苍白色, 绒毡层降解延迟, 花粉外壁发育存在缺陷, 花粉粒形状不规则, 花粉没有活力, 同时花药外壁角质层发育受到影响。因此, 我们克隆并比较了野生型和ms102突变体中DPW2基因序列, 发现ms102突变体中DPW2基因第1 708位出现碱基替换, 导致脯氨酸突变为丝氨酸; 第1 713-1 740位共28个核苷酸缺失, 导致蛋白质翻译提前终止(图7)。此外, 我们以ms102雄性不育突变体为母本, 与dpw2杂合突变体(dpw2/+)杂交, 对F₁代植株的基因型和表型进行分析, 结果发现ms102/dpw2基因型植株为雄性不育, 而ms102/+杂合体植株育性正常(图8)。以上结果表明, 控制ms102雄性不育表型的是DPW2基因上产生的新等位突变。

在前期研究中, 本课题组利用SIMM方法克隆到一系列影响水稻育性的基因(Chang et al., 2016a, 2016b, 2018, 2020; Pan et al., 2020; Peng et al., 2020; Zhang et al., 2020)。然而, 由于SIMM方法基于突变体基因组二代测序数据与参考基因组比对, 而Illumina高通量测序往往不能完全覆盖基因组序列, 造成部分信息缺失。因此获得的基因组序列无法与突变体中缺失的序列进行正确区分, 导致使用基因组重测序的方法很难识别缺失突变, 因此SIMM方法对鉴定碱基缺失突变并不敏感(Yan et al., 2017)。本研究采用SIMM方法对ms102的雄性不育突变基因进行鉴定, 发现了3个SNP候选位点, 连锁分析发现S1和S2位点都存在与突变体表型不连锁的植株, 只有S3位点与突变体表型紧密连锁。S3位于LOC_Os01g70140和LOC_Os01g70150两个基因间区, 距2个基因起始位点均在2 kb之内, 因此推测该突变可能通过影响启动子活性而影响基因功能, 对S3位点两侧基因分别敲除加以验证。然而基因敲除纯合突变体植株结实正常, 表明LOC_Os01g70140和LOC_Os01g70150不是控制ms102突变体不育表型的基因。进一步对S3位点附近的基因进行筛查, 发现距该位点约91 kb处存在1个已经报道的雄性不育基因DPW2。经基因克隆与DNA测序分析, 发现DPW2基因在ms102中发生缺失突变, 是造成ms102雄性不育的原因。因此, 利用基因组重测序、SIMM或Mut-map等方法鉴定突变位点, 在验证候选位点时, 需加大F₂分离群体的数量, 对基因型和表型进行连锁分析, 并通过基因敲除和基因组片段互补等实验进行验证。此外, 特别注意的是需要对紧密连锁的候选位点附近的基因进行分析, 若发现待研究的突变体表型与已有报道的基因表型相似时, 可通过基因克隆、DNA测序对野生型和突变体的基因片段进行比较分析, 并进行遗传验证。综合以上策略, 可快速鉴定造成表型变异的突变基因位点。

本文的其它图/表

• 表1 qRT-PCR引物序列
  
• 表2 高分辨率溶解曲线(HRM)引物序列
  
• 图1 水稻ms102突变体表型分析
  (A) 成熟期植株的表型(bar=9 cm); (B) 成熟期野生型(WT)和ms102突变体分蘖数统计(n=23); (C) 扬花期野生型和ms102突变体叶色(bar=1 cm); (D) 去掉颖壳的成熟小花(bar=1 mm); (E) 扬花期的小花, 箭头指示开裂的花药(bar=1 cm); (F), (G) 野生型和ms102突变体的成熟花粉I₂-KI染色(bars=50 μm); (H) 成熟期稻穗(bar=2.4 cm)
  
• 图2 水稻野生型(WT)和ms102突变体7-12时期花药切片
  BMs: 二核小孢子; DMs: 降解小孢子; E: 外皮层; En: 内皮层; M: 中层; Mp: 成熟花粉; Ms: 小孢子; PMC: 花粉母细胞; ST: 膨大绒毡层; T: 绒毡层; Tds: 四分体。Bars=10 μm
  
• 图3 水稻野生型(WT)和突变体(ms102)花药第9-12时期透射电镜超微结构
  (A), (D) 第9时期; (B), (E) 第10时期(箭头指示小孢子外壁); (C), (F) 第12时期; (G), (H) 分别为B和E图中虚线框的放大部分(箭头指示乌氏体); T: 绒毡层; Ms: 小孢子; C: 角质层。(A), (B), (D), (E) Bars=2 μm; (C), (F), (G), (H) Bars =1 μm
  
• 图4 水稻野生型(WT)和ms102突变体花药发育第12时期扫描电子显微镜超微结构
  (A), (C), (E), (G) 花药外表面; (B), (F) 花粉粒; (D), (H) 乌氏体。(A), (E) Bars=100 μm; (B), (C), (F), (G) Bars=10 μm; (D), (H) Bars=2 μm
  
• 图5 花药发育相关基因在野生型和ms102花药中的表达
  通过qRT-PCR检测野生型与ms102突变体中花药发育7-12时期相关基因的表达量。以OsACTIN1作为内参, 数据为平均值±标准差(n=3)。* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001
  
• 表4 候选基因及注释信息
  
• 表5 3个SNP候选位点基因型-表型连锁分析
  
• 图6 水稻LOC_Os01g70140和LOC_Os01g70150基因结构及其突变体表型
  (A) LOC_Os01g70140和LOC_Os01g70150基因结构及CRISPR突变体突变位点; (B)-(D) 花粉成熟期花药和雌蕊形态(bars=1 mm); (E)-(G) 成熟花粉粒I₂-KI染色(bars=100 μm)。
  
• 图7 水稻ms102突变体中DPW2基因突变位点分析
  黑色三角形指示碱基替换突变位点, 虚线框指示缺失的核苷酸序列。
  
• 图8 水稻突变体dpw2/+ × ms102 F₁的表型
  (A)-(D) 花粉成熟期花药和雌蕊形态(bars=1 mm); (E)-(H) 成熟花粉粒I₂-KI染色(bars=100 μm)。