利用花粉管通道技术将外源银白杨DNA导入黑杨

doi:10.11983/CBB15087

摘要/Abstract

摘要： 黑杨派杨树具有速生丰产、实用性强和无性繁殖能力强等优点; 白杨派杨树则具有材质好和抗逆性强等优点。两个派间的许多经济性状优势互补, 因此黑杨派与白杨派杂交能够获得多优势性状聚合于一体的优良杂种无性系。但黑杨派与白杨派间杂交天然不育, 为了克服黑杨派与白杨派间的远缘杂交障碍, 利用花粉管通道技术将银白杨(Populus alba)总DNA导入辽宁杨(Populus × Liaoninggensis) × N001 (P. deltoids cv. ‘N001’)。获得的D1代植株通过形态学鉴定, 发现其中4株明显具有供体银白杨的表型特征。进一步对其进行AFLP分子鉴定, 最终确定此4株变异植株均为外源银白杨DNA的阳性转化植株。该研究初步建立了黑杨花粉管通道遗传转化体系, 确定外源DNA导入黑杨的最适时间为授粉后30-72小时, 适宜方法为不切柱头滴加导入法, 最佳浓度为200 μg·mL^-1。

Abstract: Sect. Aigeiros is fast-growing and practical and has strong agamogenesis ability. Sect. Leuce has good quality and strong resistance. Many economic traits between them are complementary, so Sect. Aigeiros and Leuce hybrid advantages in polymerization can be obtained from a superior hybrid. However, there are natural incompatibility barriers between Sect. Aigeiros and Leuce. In this study, we introduced the genotype of P. alba into P. × Liaoninggensis sp. nov × P. deltoids cv. ‘N001’ by the pollen-tube pathway to overcome this difficulty. Four of the offspring were similar to P. alba by analysis of phenotype characteristics. From the molecular identification of AFLP, the 4 variant plants were determined to be positive transgenic plants from the genotype of P. alba. Meanwhile, the transformation system of the pollen-tube pathway for Sect. Aigeiros was optimized: the optimal treatment time was 30-72 h, optimal treatment method the uncut stigma method, and optimal treatment 200 μg·mL^-1.

赵鑫闻. 利用花粉管通道技术将外源银白杨DNA导入黑杨. 植物学报, 2016, 51(4): 533-541.

Xinwen Zhao. Introduction of Exogenous DNA of Populus alba into Sect. Aigeiros via Pollen-tube Pathway. Chinese Bulletin of Botany, 2016, 51(4): 533-541.

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图/表 7

表1 AFLP分析所用的接头和选择性引物

Table 1 Adaptors and selective primers used in AFLP analysis

The adaptors and primers	The nucleotide sequence of the adaptors and primers (5'→ 3')
PstI adaptors 1	CTCGTAGACTGCGTACATGCA
PstI adaptors 2	TGTACGCAGTCTAC
MseI adaptors 1	GACGATGAGTCCTGAG
MseI adaptors 2	TACTCAGGACTCAT
PstI	GACTGCGTACATGCAG
MseI	GATGAGTCCTGAGTAAC
PstI-1/MseI-2	GACTGCGTACATGCAGAA/GATGAGTCCTGAGTAACAC
PstI-1/MseI-7	GACTGCGTACATGCAGAA/GATGAGTCCTGAGTAACTG
PstI-2/MseI-1	GACTGCGTACATGCAGAC/GATGAGTCCTGAGTAACAA
PstI-2/MseI-2	GACTGCGTACATGCAGAC/GATGAGTCCTGAGTAACAC
PstI-2/MseI-3	GACTGCGTACATGCAGAC/GATGAGTCCTGAGTAACAG
PstI-3/MseI-2	GACTGCGTACATGCAGAG/GATGAGTCCTGAGTAACAC
PstI-3/MseI-3	GACTGCGTACATGCAGAG/GATGAGTCCTGAGTAACAG
PstI-3/MseI-7	GACTGCGTACATGCAGAG/GATGAGTCCTGAGTAACTG

图1 外源(银白杨)DNA导入黑杨 (A) 授粉后未切柱头处理的花序; (B) 授粉后切柱头处理的花序; (C) 外源DNA导入(未切柱头处理); (D) 外源DNA导入(切柱头处理)

Figure 1 Introduction of exogenous DNA of Populus alba into Sect. Aigeiros (A) Stigma uncut inflorescence after pollination; (B) Stigma cut inflorescence after pollination; (C) Introduction of exogenous DNA to the stigma uncut treatments; (D) Introduction of exogenous DNA to the stigma cut treatments

表2 不同处理方法和时间对外源银白杨DNA导入的影响

Table 2 The effects of different treatment methods and different time on the introduction of exogenous DNA of Populus alba

Code	Treatment method	Treatment time (h)	The No. of seeds	The No. of plants	Survival rate (%)	Variant plants
H1	Stigma uncut method	24	175	80	45.7	0
H2	Stigma uncut method	30	6	6	100	1
H3	Stigma uncut method	36	31	31	100	0
H4	Stigma uncut method	42	679	420	61.8	0
H5	Stigma uncut method	48	173	70	40.5	0
H6	Stigma uncut method	60	792	540	68.2	2
H7	Stigma uncut method	72	129	50	38.8	0
H8	Cut-stigma method	24	3	3	100	0
H9	Cut-stigma method	30	0	0	-	0
H10	Cut-stigma method	36	62	52	83.9	0
H11	Cut-stigma method	42	342	125	36.5	0
H12	Cut-stigma method	48	0	0	-	0
H13	Cut-stigma method	60	9	9	100	0
H14	Cut-stigma method	72	3	3	100	1
CK	CK		839	180	21.5	0

图2 D1代植株中的变异植株 (A) 对照(受体); (B)-(E) 分别为在处理H2 (B)、H6 (C)、H6 (D)和H14 (E)中发现的变异株

Figure 2 The variant plants found in the D1 generation (A) CK (acceptor); (B)-(E) The variant plants found in H2 (B)、H6 (C)、H6 (D) and H14 (E) treatments, respectively

图3 变异植株与亲本及供体的AFLP分析电泳图 P1: 父本; P2: 母本; CK: 对照植株(受体); No.1: 1号变异植株; No.2: 2号变异植株; No.3: 3号变异植株; No.4: 4号变异植株; M: 标记

Figure 3 AFLP electrophoretogram for parents, variant pl- ant and donor P1: Father; P2: Mother; CK: Plant CK (acceptor); No.1: Variant plant 1; No.2: Variant plant 2; No.3: Variant plant 3; No.4: Variant plant 4; M: Marker

图4 变异植株与亲本及供体的AFLP标记聚类图 P1、P2、CK、No.1、No.2、No.3和No.4同图3。

Figure 4 UPGMA dendrogram for variant plants, parents and donor based on AFLP analysis P1, P2, CK, No.1, No.2, No.3 and No.4 see Figure 3.

表3 变异植株与亲本及供体的遗传相似性

Table 3 The genetic similarity of variant plants, parents and donor

	P1	P2	Donor	CK	No.1	No.2	No.3	No.4
P1	1.00	-	-	-	-	-	-	-
P2	0.89	1.00	-	-	-	-	-	-
Donor	0.76	0.77	1.00	-	-	-	-	-
CK	0.86	0.86	0.79	1.00	-	-	-	-
No.1	0.76	0.76	0.84	0.78	1.00	-	-	-
No.2	0.75	0.75	0.82	0.78	0.83	1.00	-	-
No.3	0.77	0.77	0.84	0.79	0.86	0.83	1.00	-
No.4	0.77	0.78	0.81	0.81	0.81	0.81	0.84	1.00

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