植物学报 >

2026 , Vol. 61 >Issue 1: 37 - 52

DOI: https://doi.org/10.11983/CBB25005

牡丹TCP基因家族鉴定及TCP15a功能分析

  • 韩新蕊 1, 2 ,
  • 袁欣 2 ,
  • 高杰 2 ,
  • 王亮生 3 ,
  • 王晓晖 4 ,
  • 贾文庆 1 ,
  • 符真珠 2 ,
  • 张和臣 2
展开
  • 1 河南科技学院 新乡 453003 1 河南科技学院，新乡　453003
  • 2 河南省农业科学院园艺研究所 郑州 450002 2 河南省农业科学院园艺研究所，郑州　450002
  • 3 中国科学院植物研究所 北京 100093 3 中国科学院植物研究所，北京　100093
  • 4 洛阳市农林科学院 洛阳 471026 4 洛阳市农林科学院，洛阳　471026

* 通讯作者简介　 贾文庆（1979-），男，河南周口人，博士，教授。主要研究方向：观赏植物栽培生理及生物技术。E-mail：jiawq2012@126.com；

符真珠（1982-），女，河南信阳人，博士，副研究员。主要从事观赏植物花色形成及组培快繁相关机理研究。E-mail：pearlgh2005@163.com；

张和臣（1979-），男，河南濮阳人，博士，研究员。主要从事观赏植物花瓣呈色机理及分子设计育种研究。E-mail：zhc5128@126.com

（责任编辑：朱亚娜）

所有作者均声明不存在利益冲突

收稿日期: 2025-01-15

  录用日期: 2025-03-18

  网络出版日期: 2025-03-18

基金资助

国家自然科学基金(32030095)

河南省联合基金(242301420128)

河南省农业科学院创新团队(2024TD36)

河南省科技攻关项目(242102110269)

中央引导计划(Z20241471128)

版权

©The author(s) 2026. This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 license (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)
收起

Identification of TCP Gene Family and Functional Analysis of TCP15a of Tree Peony

  • Xinrui Han 1, 2 ,
  • Xin Yuan 2 ,
  • Jie Gao 2 ,
  • Liangsheng Wang 3 ,
  • Xiaohui Wang 4 ,
  • Wenqing Jia 1 ,
  • Zhenzhu Fu 2 ,
  • Hechen Zhang 2
Expand
  • 1 Henan Institute of Science and Technology Xinxiang 453003 China 1 Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China
  • 2 Horticultural Research Institute Henan Academy of Agricultural Sciences Zhengzhou 450002 China 2 Horticultural Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China
  • 3 Institute of Botany Chinese Academy of Sciences Beijing 100093 China 3 Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China
  • 4 Luoyang Academy of Agricultural and Forestry Sciences Luoyang 471026 China 4 Luoyang Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Luoyang 471026, China

* Authors for correspondence. E-mail: jiawq2012@126.com;

pearlgh2005@163.com;

zhc5128@126.com

The authors declare that there is no conflict of interests

Received date: 2025-01-15

  Accepted date: 2025-03-18

  Online published: 2025-03-18

Fold

摘要

为探明TCP转录因子家族在牡丹（Paeonia × suffruticosa）花瓣呈色过程中的作用，为牡丹花色改良和分子育种提供候选基因，对牡丹TCP家族基因进行鉴定和生物信息学分析，并对可能参与花色调控的基因TCP13和TCP15a进行功能分析。结果表明，在3个牡丹基因组中共鉴定出26个TCP家族成员，分为2个亚族3个亚类，不规则分布在5条染色体上；不同成员的理化性质和基因结构存在差异，但均含有TCP保守结构域。在矮牵牛（Petunia hybrida）花瓣中瞬时表达TCP13和TCP15a，发现TCP13对MYB57诱导的紫色表型无明显作用，而TCP15a可显著抑制该表型；荧光定量PCR分析表明，TCP15a可以显著抑制MYB57诱导浸染的花瓣组织内花青素苷合成酶基因CHSa、DFR和ANS的表达。进一步通过蛋白互作鉴定发现，TCP15a与MBW蛋白复合体成员WD40-1和WD40-2互作。TCP15a通过与MYB57竞争与WD40的相互作用，影响MBW复合体的形成，进而抑制MYB57对花青素苷合成酶基因的调控作用。研究结果为阐明牡丹TCP家族基因功能奠定理论基础，为牡丹花色定向育种提供了有价值的线索。

本文引用格式

韩新蕊 , 袁欣 , 高杰 , 王亮生 , 王晓晖 , 贾文庆 , 符真珠 , 张和臣 . 牡丹TCP基因家族鉴定及TCP15a功能分析[J]. 植物学报, 2026 , 61(1) : 37 -52 . DOI: 10.11983/CBB25005

牡丹（Paeonia × suffruticosa）起源于中国，是我国著名观赏花卉，被誉为“花中之王”（Suo et al.，2008）。花色是评价牡丹观赏价值的重要性状之一。牡丹的花色主要受花青素苷、黄酮和黄酮醇组成的类黄酮类化合物调控，其中花青素苷在牡丹花瓣呈色中发挥主要作用（张晶晶等，2006）。在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）、金鱼草（Antirrhinum majus）和矮牵牛（Petunia hybrida）中的研究发现，植物花青素苷的生物合成主要受2类基因控制：一类是直接参与色素代谢过程的酶基因，如早期生物合成基因查尔酮合成酶基因（CHSa）、查尔酮异构酶基因（CHI），以及晚期合成的二氢黄酮醇4-还原酶基因（DFR）和花青素苷合成酶基因（ANS）（Yang et al.，2021）；另一类是起调控作用的转录因子，如MYB、bHLH、WD40和TCP（teosinte branched1/cincinnata/proliferating-cell factor）转录因子家族成员（Xu et al.，2015）。
TCP家族是植物特有的转录因子，广泛参与植物细胞的生长发育与分化，涉及种子萌发（Takeda et al.，2003）、花和侧枝生长（Yang et al.，2023）、植物器官形成（Li et al.，2021）及次生代谢生物合成（Zhang et al.，2021a）等多个生物学过程。根据保守结构域序列分析，TCP基因家族分为2个亚家族：Class I，亦称PCF类（Viola and Gonzalez，2023）或TCP-P类（Martín-Trillo and Cubas，2010）；Class II，亦称TCP-C类，其进一步划分为2个亚类CYC/TB1和CIN（Kosugi and Ohashi，1997）。TCP一般都具有碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）结构，其通常由58–62个氨基酸残基组成，能参与结合DNA并与蛋白互作（Cubas et al.，1999；Martín-Trillo and Cubas，2010）。研究表明，在拟南芥中AtTCP3可以通过与R2R3-MYBs-TT8互作，正向调控类黄酮的生物合成（张云洁等，2014）；但AtTCP15通过抑制TT8和DFR等的表达，AtTCP13通过抑制TT8、PAP1和PAP2等的表达，抑制类黄酮（花青素苷）合成（Viola et al.，2016；Hur et al.，2024）。草莓（Fragaria × ananassa）FvTCP9可通过与FaMYC1互作，提高花青素苷的含量（谢尹歌，2019）。近年来，已鉴定和分析了越来越多植物物种的TCP家族，如在拟南芥（Tatematsu et al.，2008）、水稻（Oryza sativa）（关紫微等，2022）、玉米（Zea mays）（孙菡笛等，2021）、金银花（Lonicera Japonica）（谭政委等，2024）、番木瓜（Carica papaya）（周汪洋等，2024）、滇杨（Populus yunnanensis）（陈智华等，2024）和狗牙根（Cynodon dactylon）（孙启雪等，2024）中分别鉴定出23、27、43、17、22、38和65个TCP家族成员，但是关于牡丹的TCP研究尚未见报道。
本研究通过深入挖掘牡丹基因组数据，鉴定了牡丹TCP基因家族，分析其理化性质、基因结构和保守基序等特性；并通过瞬时表达和酵母双杂交等明确了TCP15a基因的分子功能，为阐明TCP调控牡丹花色的机制提供了思路。

1 材料与方法

1.1 植物材料

本研究基因克隆材料选取牡丹海黄（Paeonia suffruticosa ‘High Noon’），采集自洛阳市农林科学院资源圃，采集时间为2023年5月上旬；亚细胞定位和瞬时转化材料选取矮牵牛W59 × axi株系（白色花），来源于河南省农业科学院园艺研究所人工气候室。

1.2 实验方法

1.2.1 牡丹TCP家族成员鉴定、理化性质分析及系统进化树构建

首先利用TBtools将已公布的牡丹基因组数据库洛神晓春（Paeonia suffruticosa ‘Luo shen xiao chun’）（CNP0000281）（Lv et al.，2020）、杨山牡丹（Paeonia ostia）（CNP0003098）（Yuan et al.，2022）和大花黄牡丹（Paeonia ludlowii）（PRJCA016714）（Xiao et al.，2023）进行blast，获得牡丹中的候选TCP家族成员。然后从Pfam数据库（http://pfam-legacy.xfamorg/family/browse）下载TCP转录因子的隐马尔科夫模型（hindden market model，HMM）文件（登录号：PF03634），进一步筛选TCP家族成员。最后对3个基因组的候选基因进行比对分析，去除冗余序列，鉴定出牡丹TCP家族成员。采用ExPasy（http://web.expasy.org/protparam）在线工具分析牡丹TCP蛋白的理化性质，包括蛋白长度、理论等电点和分子量等。
利用MEGA 11软件基于邻接法（neighbor-joining，NJ）（Bootstrap=1 000）将牡丹TCP基因与拟南芥TCP基因（http://www.arabidois.org）进行分析，构建系统进化树。最后利用iTOL（http://itol.embl.de）在线工具对系统发育树进行美化。

1.2.2 牡丹TCP蛋白二级结构及保守域三级结构预测

利用SOPMA（http://na-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/na_automat.plpage=na_sopma.html）以及Phyre 2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）软件分别预测牡丹TCP蛋白二级结构和保守域三级结构。

1.2.3 牡丹TCP基因结构、染色体定位及保守基序分析

根据牡丹基因组注释信息，利用TBtools获得染色体定位和牡丹TCP基因外显子-内含子结构。通过MEME数据库（http://meme-suite.org/meme）对TCP蛋白的保守基序进行预测，使用CDD在线软件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）对TCP蛋白结构域进行预测。使用DNAMAD软件对牡丹TCP蛋白的氨基酸序列进行多重比对。

1.2.4 牡丹TCP13和TCP15a基因克隆及载体构建

以牡丹海黄的花瓣混样为材料，使用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction试剂盒提取总RNA。用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（宝生物工程有限公司，大连）将总RNA反转录成cDNA，扩增并克隆牡丹TCP13和TCP15a基因。所用引物如下：TCP13-Fw：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGATAACAACTTCAAGG-GAAG-3′，TCP13-Rv：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACTAGGTGTCTTTATTTGGC-TG-3′；TCP15a-Fw：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGAAGGAGGAGGTGAT-GATC-3′，TCP15a-Rv：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATTATGAGTGGTGACTGGTTGTG-3′。使用胶回收试剂盒TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit（宝生物工程有限公司，大连）回收纯化目的基因。
用GatewayTM BP ClonaseTM II Enzyme Mix试剂盒（Life Technologies Corp，USA）构建入门载体TCP13-pDONR207和TCP15a-pDONR207。用GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix试剂盒（Life Technologies Corp，USA）构建基因过表达载体TCP13-pK2GW7.0/rfa（p35S：TCP13）、TCP15a-pK2GW 7.0/rfa（p35S：TCP15a）和TCP15a-pK7WGF2.0/rfa（p35S：GFP-TCP15a和pK7WGF2.0/rfa含有绿色荧光标记蛋白GFP），以及酵母双杂交载体TCP15a-pGBKT7（TCP15a：BD）。

1.2.5 牡丹TCP13和TCP15a瞬时表达及荧光定量分析

过表达牡丹MYB57可诱导花青素苷积累（Zhang et al.，2020，2021b）。AtTCP15和AtTCP13通过抑制类黄酮（花青素苷）的合成影响花瓣呈色（Viola et al.，2016；Hur et al.，2024）。本研究通过瞬时表达初步验证牡丹TCP13和TCP15a基因对花青素苷是否具有调控作用。具体步骤如下：将构建成功的载体转入农杆菌后，取农杆菌转化液p35S：MYB57、pK2GW7.0/rfa（空载体）、p35S：TCP13、p35S：TCP15a、p35S：MYB57+ pK2GW7.0/rfa（空载体）、p35S：MYB57+p35S：TCP13和p35S：MYB57+p35S：TCP15a注射至初开期的矮牵牛W59 × axi花瓣中。其中，农杆菌菌液p35S：MYB57和pK2GW7.0/rfa，p35S：MYB57和p35S：TCP13，p35S：MYB57和p35S：TCP15a分别按1：1（v/v）比例混合，将转化液p35S：MYB57+pK2GW7.0/rfa、p35S：MYB57+p35S：TCP13和p35S：MYB57+p35S：TCP15a注射后的植株放入人工气候室中培养，观察表型变化（p35S：MYB57质粒为本课题组前期实验构建的表达载体质粒）。
采集瞬时表达24小时后注射区域的花瓣，利用TransZol法提取RNA，利用PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒合成cDNA，利用SYBR® Premix Ex Taq™试剂盒（宝生物工程有限公司，大连）进行荧光定量PCR（qRT-PCR）分析。以矮牵牛actin基因作为内参基因，采用2−ΔΔCT方法计算各基因的相对表达量。设3次重复。采用SPSS软件进行数据统计分析。荧光定量PCR引物见表1。
表1 qRT-PCR所用引物

Table. 1 Primers for qRT-PCR testing

Gene

Forward primer sequence（5′–3′）

Reverse primer sequence（5′–3′）

CHSa

CAACTAGTGGTGTGGACATGCC

CACCAGCAAAGCAACCTTGTT

CHI

TCTCCTCCAGTGTCCGTTACTAAA

ACTTCCCTTCTATCTCCAGACCTC

F3′H

AGCTGGACGTAGGATTTGTG

ATGGATCAGCCCGTTGTAAG

F3′5′H

ATAGGCGTTTACTCGAATCCG

TGGTGTAGAAGGGTGTTTTCG

DFR

CCCCTAGTTTAATCACTGCCC

GACCATCTTAGCCACATCGTAG

ANS

TCTTCCATTGTGCTTTCCCTG

GTTGCTGGAGTGTAGTCAGTAG

RT

CAGGGCTTCCTTTCTTTCTTGTCT

TCCCCTTGTCTTTCACTCTTTCC

MT2

GCAGCGAGCTTTATGGGTCTT

TGAGCTTTAGGAACATCGATAGAAAC

MF1+MF2

CTTTTGGCTACTGCTCTTGCATT

CTCTGTCCGGATCAATCGCTAT

GST

GGTGACCAAGAGAAAGTGTTTGC

GCTGGGATAGACACTGCTTCA

actin

AGCCAACAGAGAGAAGATGACCCA

ACACCATCACCAGAGTCCAACACA

1.2.6 牡丹TCP15a亚细胞定位

以p35S：RFP-PH3融合表达载体质粒（由荷兰阿姆斯特丹大学Ronald Koes实验室提供）。PH3基因编码WRKY蛋白，定位于细胞核（Verweij et al.，2016），作为核定位阳性对照，以明确目标蛋白的具体定位信息。具体步骤如下：将携带pK7WGF2.0/rfa空载体质粒、p35S：GFP-TCP15a载体质粒和p35S：RFP-PH3载体质粒的农杆菌菌液培养至OD600≈0.6后，用含乙酰丁香酮的1/2MS侵染缓冲液重悬菌体，将重悬液p35S：GFP-TCP15a和p35S：RFP-PH3，pK7WGF2.0/rfa（空载体）和p35S：RFP-PH3分别按1：1（v/v）比例混合，获得转化液后注射至初开期的矮牵牛W59 × axi花瓣。黑暗培养1天后再光照培养1天，剪取注射部位组织，利用荧光显微镜ECHO（艾普拜生物科技有限公司）进行亚细胞定位观察。

1.2.7 酵母双杂交

首先利用PEG法将TCP15a：BD转化至酵母AH109感受态细胞，经SD–Trp营养缺陷培养基筛选获得重组的TCP15a：BD酵母。然后利用重组后的TCP15a：BD酵母分别将MYB57：AD（MYBs-SG6a：AD）、MYB58：AD（MYBs-SG6b：AD）、MYBs-SG4a：AD、bHLH1：AD、WD40-1：AD和WD40-2：AD等进行共转化，载体MYB57：AD（MYBs-SG6a：AD）、MYB58：AD（MYBs-SG6b：AD）、MYBs-SG4a：AD、bHLH1：AD、WD40-1：AD和WD40-2：AD为本课题组前期实验构建。经SD–Leu/–Trp缺陷型培养基获得2个蛋白的重组酵母。最后通过SD–Leu/–Trp/–His/–Ade缺陷型培养基+X-α-gal平板对蛋白进行互作关系鉴定。

2 结果与分析

2.1 牡丹TCP基因家族成员系统进化分析、分类及鉴定

对3个牡丹基因组的候选基因进行分析，比对去除重复冗余的序列，从基因组Paeonia suffruticosa ‘Luo shen xiao chun’（CNP0000281）筛选出12个TCP基因，从基因组Paeonia ostia（CNP0003098）筛选出22个TCP基因，从基因组Paeonia ludlowii（PRJCA016714）筛选出14个TCP基因。通过序列比对分析，发现基因组Paeonia ostii的TCP家族包含的基因最多且有6个特异基因（TCP5a-Pos.gene3141、TCP5b-Pos. gene3142、TCP7a-Pos.gene49570、TCP12a-Pos. gene45291、TCP14b-Pos.gene82182和TCP15b- Pos.gene43777），从基因组Paeonia suffruticosa ‘Luo shen xiao chun’中筛选出4个特异TCP基因（TCP7b-Psu.T.00012308.1、TCP9b-Psu.T.00008119.1、TCP10-Psu.T.00004485.1和TCP14a-Psu.T.00014829.1），基因组Paeonia ludlowii中无特异基因。因此，以基因组Paeonia ostii的22个TCP基因为主，结合基因组Paeonia suffruticosa ‘Luo shen xiao chun’中的4个特异TCP基因，共鉴定出26个TCP家族成员（表2）。
表2 牡丹TCP家族成员的理化性质分析

Table 2 Analysis of physical and chemical properties of TCP family members in tree peony

Gene name

Gene ID

Gene ID

Gene ID

Protein length（aa）

pI

Molecular weight（kDa）

Conserved domains

TCP1

Pos.gene11379

PL-2G122130.1

Psu.T.00000087.1

339，339，307

9.02，8.92，9.59

37.75，37.89，33.98

TCP superfamily

TCP2

Pos.gene53232

PL-4G132790.1

Psu.T.00000478.1

503，465，464

9.02，7.16，7.14

54.83，50.50，50.20

TCP2

TCP3

Pos.gene72619

PL-2G273790.1

Psu.T.00034421.1

473，473，530

5.83，5.78，7.2

51.69，51.73，58.39

TCP superfamily

TCP5a

Pos.gene3141

/

/

134，/，/

9.51，/，/

15.49，/，/

TCP2 superfamily

TCP5b

Pos.gene3142

/

/

83，/，/

10.06，/，/

9.79，/，/

TCP2 superfamily

TCP7a

Pos.gene49570

/

/

267，/，/

9.64，/，/

29.89，/，/

TCP superfamily

TCP7b

/

/

Psu.T.00012308.1

/，/，107

/，/，9.88

/，/，12.16

TCP superfamily

TCP8

Pos.gene73497

PL-5G111400.1

/

203，217，/

8.33，7.66，/

21.94，23.23，/

TCP superfamily

TCP9a

Pos.gene42145

PL-3G121530.1

/

352，346，/

7.84，8.55，/

37.60，37.16，/

TCP superfamily

TCP9b

/

/

Psu.T.00008119.1

/，/，282

/，/，9.37

/，/，29.99

TCP superfamily

TCP10

/

/

Psu.T.00004485.1

/，/，325

/，/，6.89

/，/，36.38

TCP superfamily

TCP12a

Pos.gene45291

/

/

562，/，/

9.38，/，/

65.01，/，/

TCP

TCP12b

Pos.gene7348

PL-5G147810.1

/

403，270，/

8.08，9.35，/

45.22，30.17，/

TCP

TCP13

Pos.gene72744

PL-2G116620.1

/

729，357，/

6.25，6.9，/

80.39，39.63，/

TCP2 superfamily

TCP14a

/

/

Psu.T.00014829.1

/，/，198

/，/，10.12

/，/，22.30

TCP superfamily

TCP14b

Pos.gene82182

/

/

220，/，/

9.78，/，/

24.15，/，/

TCP superfamily

TCP15a

Pos.gene36892

/

Psu.T.00029341.1

371，/，371

6.67，/，6.67

39.83，/，39.83

TCP

TCP15b

Pos.gene43777

/

/

333，/，/

9.62，/，/

37.23，/，/

TCP

TCP15c

Pos.gene61444

/

Psu.T.00005566.1

543，/，128

5.88，/，11.2

60.73，/，14.38

TCP

TCP15d

Pos.gene27661

PL-1G208530.1

/

356，354，/

7.82，7.82，/

38.31，38.00，/

TCP superfamily

TCP17

Pos.gene78687

PL-UG256570.1

/

440，378，/

9.12，9.36，/

49.28，42.08，/

TCP2 superfamily

TCP18

Pos.gene72830

PL-5G126440.1

Psu.T.00026341.1

507，701，200

6.29，7.55，9.6

55.75，78.12，21.96

TCP superfamily

TCP19

Pos.gene75864

PL-1G133380.1

/

377，377，/

5.26，5.26，/

39.82，39.82，/

TCP superfamily

TCP20

Pos.gene22067

PL-2G301650.1

Psu.T.00007142.1

307，306，309

8.68，8.68，8.68

32.98，32.88，33.24

TCP superfamily

TCP21

pos.gene79130

PL-2G150160.1

Psu.T.00026535.1

261，261，261

9.45，9.45，9.45

27.42，27.36，27.42

TCP superfamily

TCP23

Pos.gene34937

PL-5G204500.1

/

356，356，/

7.91，7.91，/

37.92，37.91，/

TCP

为明确TCP基因家族的系统进化关系，对26个牡丹TCP蛋白和24个拟南芥TCP蛋白进行系统发育分析，并根据拟南芥TCP蛋白命名方式依次命名为牡丹TCP1–TCP23（图1）。以拟南芥TCP蛋白家族的分类方法为参考，可将26个牡丹TCP分为Class I和Class II 2个亚家族，其中PCF亚类属于Class I亚家族，CIN亚类与CYC亚类属于Class II亚家族。牡丹中3个亚类的分布情况为PCF亚类有15个成员，CIN亚类有7个成员，CYC亚类有4个成员。Class I和Class II的拟南芥TCP和牡丹TCP，包括4对直系同源基因TCP1、TCP2、TCP12和TCP20，亲缘关系较近。PCF亚类TCP14和TCP15分支，牡丹基因组有6个成员，在数量上是拟南芥的3倍。
图1 牡丹与拟南芥TCP蛋白的系统进化关系

Figure 1 Phylogenetic relationship between TCP protein of tree peony and Arabidopsis

26个牡丹TCP家族成员均含有TCP保守结构域，分析TCP蛋白的理化性质，发现其蛋白长度在83 aa（TCP5b）–729 aa（TCP13）之间；等电点在5.26（TCP19）–10.12（TCP14a）之间；蛋白分子量在9.79 kDa（TCP5b）–80.39 kDa（TCP13）之间（表2）。

2.2 TCP蛋白二级结构分析及保守域三级结构预测

二级结构分析显示，TCP蛋白主要由α螺旋、无规则卷曲、延伸链和β转角组成，其占比顺序均为无规则卷曲>α螺旋>延伸链>β转角。在牡丹TCP蛋白的二级结构中，除TCP15c的无规则卷曲占比41.25%外，其它TCP蛋白的无规则卷曲占比均在50%以上；除TCP15c和TCP12a的α螺旋占比在30%以上，其它TCP蛋白的α螺旋占比均在30%以下；除TCP15c的延伸链占比17.31%外，其它TCP蛋白的延伸链占比均在15%以下；除TCP12a的β转角占比5.16%外，其它TCP蛋白的β转角占比均在5%以下（表3）。不同的蛋白空间结构决定功能的差异，牡丹TCP保守域三级结构非常相似，无规则卷曲占比最大，与二级结构分析结果一致（图2）。
表3 牡丹TCP基因家族的二级结构分析

Table 3 Second structure analysis of the TCP gene family in tree peony

Gene name

Alpha helix（proportion）

Extended strand（proportion）

Beta turn（proportion）

Random coil（proportion）

Subgroup

TCP15a

33（8.89%）

20（5.39%）

5（1.35%）

313（84.37%）

PCF

TCP15b

26（7.81%）

17（5.11%）

3（0.90%）

287（86.19%）

TCP15c

200（36.83%）

94（17.31%）

25（4.60%）

224（41.25%）

TCP15d

41（11.52%）

12（3.37%）

5（1.40%）

298（83.71%）

TCP14a

26（13.13%）

9（4.55%）

2（1.01%）

161（81.31%）

TCP14b

26（11.82%）

12（5.45%）

4（1.82%）

178（80.91%）

TCP23

37（10.39%）

15（4.21%）

8（2.25%）

296（83.15%）

TCP8

53（26.11%）

7（3.45%）

3（1.48%）

140（68.97%）

TCP7a

45（16.85%）

29（10.86%）

10（3.75%）

183（68.54%）

TCP7b

25（23.36%）

8（7.48%）

3（2.80%）

71（66.36%）

TCP21

38（14.56%）

11（4.21%）

2（0.77%）

210（80.46%）

TCP20

38（12.38%）

8（2.61%）

5（1.63%）

256（83.39%）

TCP9a

33（9.38%）

24（6.82%）

6（1.70%）

289（82.10%）

TCP9b

19（6.74%）

19（6.74%）

6（2.13%）

238（84.40%）

TCP19

44（11.67%）

19（5.04%）

7（1.86%）

307（81.43%）

TCP18

143（28.21%）

73（14.40%）

20（3.94%）

271（53.45%）

CYC

TCP12a

193（34.34%）

58（10.32%）

29（5.16%）

282（50.18%）

TCP12b

92（22.83%）

21（5.21%）

4（0.99%）

286（70.97%）

TCP1

85（25.07%）

9（2.65%）

1（0.29%）

244（71.98%）

TCP3

43（9.09%）

16（3.38%）

2（0.42%）

412（87.10%）

CIN

TCP10

42（12.92%）

24（7.38%）

2（0.62%）

257（79.08%）

TCP2

77（15.31%）

29（5.77%）

5（0.99%）

392（77.93%）

TCP13

151（20.71%）

99（13.58%）

27（3.70%）

452（62.00%）

TCP5a

17（12.69%）

8（5.97%）

1（0.75%）

108（80.60%）

TCP5b

19（22.89%）

8（9.64%）

2（2.41%）

54（65.06%）

TCP17

57（12.95%）

30（6.82%）

2（0.45%）

351（79.77%）

图2 牡丹TCP蛋白保守域三级结构预测

Figure 2 Prediction of conserved domain tertiary structure of tree peony TCP protein

2.3 牡丹TCP家族成员的染色体定位及基因结构

依据杨山牡丹基因组数据库对22个TCP家族成员进行染色体定位分析（图3A），发现TCP基因主要分布在5条染色体，其中TCP8和TCP13未被定位到具体染色体。Chr01和Chr04染色体上分布的TCP基因最多（5个）；其次为Chr02和Chr03染色体（有4个TCP基因分布）；仅有2个TCP基因分布在Chr05染色体。根据大花黄牡丹基因组数据对14个TCP家族成员进行染色体定位分析，发现TCP基因分布在5条染色体上。由于杨山牡丹和大花黄牡丹基因组数据的染色体序号命名不一致，为方便后续分析，本研究依据相同基因在染色体上的分布，以杨山牡丹基因组数据中染色体序号为参照调整了大花黄牡丹基因组数据中染色体排序，对应关系为：序号Chr2为原Chr5、序号Chr4为原Chr2、序号Chr5为原Chr4（图3B）。在杨山牡丹基因组染色体定位分析中，Chr4染色体上分布的TCP基因最多（5个）；其次为Chr2染色体（4个）；剩余3条染色体仅有1–2个TCP基因分布。其中，TCP17未被定位到染色体上。
图3 牡丹TCP基因的染色体定位及基因结构分析

Figure 3 Chromosomal localization and gene structure analysis of TCP gene in tree peony

为研究牡丹TCP基因结构特征，利用现有的杨山牡丹基因组注释数据分析了22个TCP基因的外显子-内含子结构（图3C）。结果表明，22个TCP基因中有7个无内含子（TCP15a、TCP23、TCP8、TCP21、TCP20、TCP9a和TCP19）。TCP家族成员非翻译区（UTR）的分布也不均匀，其数量在0–3个之间，其中有6个基因（TCP15c、TCP15d、TCP18、TCP12b、TCP1和TCP2）的序列预测到非翻译区。值得注意的是在Class II的CYC亚类中仅TCP12a基因不含UTR。利用现有的大花黄牡丹基因组数据库分析了14个TCP基因的外显子-内含子结构（图3D）。结果表明，与杨山牡丹相关成员的基因结构相比，大花黄牡丹基因组数据库中的14个TCP基因均未预测到UTR。

2.4 牡丹TCP保守结构域、基序及氨基酸序列分析

分析26个牡丹TCP蛋白（由Paeonia ostii基因组22个TCP成员和Paeonia suffruticosa基因组4个特异成员组成）的保守结构域，结果表明牡丹TCP蛋白均含有保守的TCP结构域。其中，第I亚族PCF亚类的15个成员中，有4个成员（TCP15a、TCP15b、TCP15c和TCP23）的保守结构域为TCP结构域，其它11个成员（TCP15d、TCP14a、TCP14b、TCP8、TCP7a、TCP7b、TCP21、TCP20、TCP9a、TCP9b和TCP19）的保守结构域为TCP superfamily结构域。第II亚族中，CYC亚类的4个成员，TCP12a和TCP12b的保守结构域为TCP结构域，TCP18和TCP1的保守结构域为TCP superfamily结构域；CIN亚类的7个成员，仅TCP2的保守结构域为TCP2结构域，TCP3和TCP10的保守结构域为TCP superfamily结构域，其它4个成员（TCP13、TCP5a、TCP5b和TCP17）的保守结构域为TCP2 superfamily结构域（图4A）。
图4 牡丹TCP蛋白的保守结构域、基序分析与氨基酸序列分析

Figure 4 Conserved domain, motif analysis and amino acid sequence analysis of tree peony TCP protein

为深入解析牡丹TCP家族成员蛋白保守基序组成，对TCP蛋白进行保守基序分析（4B），共鉴定到12个motif，每个基序的氨基酸组成如图4C所示。结果表明，第I亚族的15个成员除TCP7a外均含Motif1，除TCP7b外均含Motif2；第II亚族的11个成员均含有Motif1，除TCP5a和TCP5b外均含Motif3，除TCP18外均含Motif6。表明Motif1在TCP蛋白序列中分布最广、保守程度最高，其次是Motif2、Motif3和Motif6。同一亚族的TCP蛋白含有相似的保守基序，而不同亚族的motif类型、数量以及位置等差异较大。
对牡丹TCP蛋白进行多序列比对，发现牡丹TCP蛋白有多个保守氨基酸位点，如亮氨酸（L）、精氨酸（R）和组氨酸（H）（图4D）。其中，TCP2 superfamily结构域的保守氨基酸位点最多（28个）；TCP结构域的保守氨基酸位点最少（2个）。在TCP结构域的成员中，TCP12a和TCP12b与其它成员的氨基酸序列不一致程度最高，结合图4A和B，发现仅TCP12a和TCP12b含有Motif6和Motif10。

2.5 牡丹TCP13和TCP15a基因克隆及瞬时表达分析

本研究对可能参与花瓣呈色的牡丹TCP13和TCP15a基因进行全长克隆，测序得到TCP13的序列长度为1 068 bp，TCP15a的序列长度为1 116 bp（图5A）。通过验证获得含有TCP13和TCP15a基因的农杆菌转化菌液（图5B）。在矮牵牛花瓣中瞬时转化，发现p35S：MYB57、p35S：MYB57+pK2GW7.0/rfa和p35S：MYB57+p35S：TCP13浸染2天后可以促进矮牵牛花瓣浸染部位呈现紫色表型，而p35S：MYB57+p35S：TCP15a、pK2GW7.0/rfa（空载）、p35S：TCP13和p35S：TCP15a浸染的区域无任何显色表型（图5C）。上述结果表明，对牡丹TCP13和TCP15a进行单一基因瞬时转化，花瓣无浸染表型变化。对于MYB57诱导的色素积累表型，牡丹TCP13无明显抑制特性，而TCP15a对MYB57诱导的色素积累表型起明显抑制作用。
图5 TCP15a和TCP13基因PCR扩增电泳图及瞬时转化表型变化

Figure 5 PCR amplification electrophoresis of TCP15a and TCP13 genes and instantaneous transformation phenotypic changes

为进一步确定牡丹TCP15a对花青素苷的调控作用，本研究分析了p35S：MYB57+p35S：TCP15a瞬时表达后，花青素苷合成酶基因的表达变化，以p35S：MYB57作为浸染对照。结果表明，注射p35S：MYB57+p35S：TCP15a后，CHSa、CHL、DFR、ANS、F3′5′H、RT、MT2、MF1+MF2和GST基因的相对表达量均显著下降（图6）。值得注意的是，F3′H表达量与对照相比显著升高。以上结果表明，牡丹TCP15a对花青素苷的合成具有调控作用，其可以通过影响MYB57的功能间接负调控花青素苷的合成。
图6 过表达MYB57+TCP15a对花青素苷合成相关结构基因的诱导特性

Figure 6 The induction characteristics of overexpression of MYB57+TCP15a on structural genes related to anthocyanin synthesis

2.6 牡丹TCP15a亚细胞定位及互作蛋白鉴定

在矮牵牛W59 × axi花瓣中注射带有GFP蛋白的融合表达载体与p35S：RFP-PH3的重组转化液，亚细胞定位表明TCP15a定位于细胞核（图7A）。通过酵母双杂交检测其与牡丹MBW复合体成员MYBs-SG6a、MYBs-SG6b、MYBs-SG4、bHLH和WD40等编码蛋白的互作特性。结果表明，在SD–Leu/–Trp营养缺陷型固体培养基中可见正常生长的TCP15a：BD和待检测组合蛋白酵母菌斑（图7B），说明转化成功。其中，菌株TCP15a：BD+WD40-1：AD和TCP15a：BD+WD40-2：AD能够在SD–Leu/Trp/His/Ade营养缺陷型固体培养基中正常生长且在X-α-gal背景色上呈现蓝色，说明TCP15a与WD40-1和WD40-2互作。
图7 TCP15a的亚细胞定位及酵母双杂交

Figure 7 Subcellular localization and yeast two-hybrid of TCP15a

3 讨论

花色是牡丹最重要的观赏性状之一，花瓣的呈色过程受到外部环境、内部结构基因和转录因子等多因素调控（符真珠等，2024）。大量研究表明，转录因子TCP不仅参与植物次生代谢调控、生物和非生物胁迫响应，也参与类黄酮和叶绿素的合成调控（张云洁等，2014；Li et al.，2021；Yang et al.，2023）。本研究鉴定的26个TCP家族成员中，有4个基因为洛神晓春中特有，有6个基因为杨山牡丹中特有，这可能是由于不同牡丹种群的基因重组和自然选择等多种进化机制出现了基因型差异的结果（Sreedasyam et al.，2024）。分别在杨山牡丹和大花黄牡丹2个基因组中对牡丹TCP基因进行染色体定位分析，表明TCP8和TCP13与TCP17仅在一个基因组上有具体定位信息。这种个别基因未能定位到染色体上的情况可能是基因组拼接不完整导致。由于同种生物染色体在形态和数目上总体一致且等位基因位于同源染色体的相同位置（梁红，2018），本研究通过不同牡丹基因组的比对分析，推测杨山牡丹TCP8和TCP13分别定位于Chr02和Chr04，而大花黄牡丹TCP17定位于Chr3。对牡丹TCP基因进行基因结构预测分析，发现TCP18、TCP12b和TCP17等基因在2个牡丹物种中的结构不一致，这种表现可能是由于牡丹在进化过程中发生了染色体重组和突变等事件（Zhang et al.，2024）。TCP蛋白均含有TCP结构域，保守基序Motif2仅存在于Class I成员中，Motif6仅存在于Class II成员中。说明Motif2和Motif6的氨基酸序列排序可能在亚族划分中发挥作用。
研究表明，在烟草（Nicotiana tabacum）中过表达牡丹MYB57基因可诱导花青素苷积累（Zhang et al.，2020，2021b）。本研究在矮牵牛W59 × axi花瓣中进行瞬时转化，发现过表达牡丹MYB57基因可重现花青素苷积累的表型，而单独过表达TCP13或TCP15a未引起表型变化。有意思的是，MYB57+TCP15a共转化可以抑制MYB57介导的花青素苷积累。花青素苷合成途径中，二氢黄酮醇（DHK）在F3′H、F3′5′H、DFR和ANS催化后形成了有色花青素苷（Grotewold，2006；张云洁等，2014；王峰等，2020）。本研究分析了花青素苷代谢通路基因的表达特性，发现瞬时表达MYB57+TCP15a后，除F3′H基因表达显著升高外，另外9个关键的合成结构基因（CHSa、CHL、DFR、ANS、F3′5′H、RT、MT2、MF1+MF2和GST）的表达均显著下降。在矮牵牛中，R2R3-MYB家族SG6成员主要调控F3′5′H为分支点的飞燕草色素途径，而对F3′H控制的矢车菊素途径无影响（符真珠等，2021）。本研究中瞬时表达MYB57+TCP15a后F3′H基因表达显著上调，F3′5′H基因下调，说明TCP15a除与SG6存在互作竞争，也可能影响其它类型的R2R3-MYB成员。转录因子R2R3-MYB、bHLH和WD40组成的MBW蛋白复合体已被证实是花青素苷生物合成的主要分子模块，参与形成MBW分子模块的R2R3-MYB成员包括SG4、SG5、SG6和SG20等（Zimmermann et al.，2004）。本研究进一步通过酵母双杂交实验发现，TCP15a与MBW复合体成员WD40-1和WD40-1存在互作，也说明TCP15a可能影响多个类型的R2R3-MYB成员与WD40蛋白的互作。在拟南芥中，TCP15主要通过与R2R3-MYB互作，调控酶基因TT8和DFR的表达从而抑制花青素苷的生物合成（Viola et al.，2016）。这表明TCP15基因在牡丹和拟南芥中的调控机制既有共性，也有差异。在牡丹中，已经鉴定发现参与花色调控的R2R3-MYB成员，如SG6成员MYB57和MYB58，SG5成员PrMYBa2和PsMYB114L等，TCP15a在花瓣呈色调控过程中与哪些R2R3-MYB成员具有竞争关系，以及具体的转录调控机制有待深入研究。
综上，本研究通过挖掘牡丹基因组数据，筛选鉴定了26个TCP基因家族成员，通过生物信息学分析TCP基因编码氨基酸的特性、进化关系及基因结构，发现牡丹TCP15a通过竞争MYB57，与WD40互作，调控酶基因DFR、ANS和F3′5′H等的表达来抑制花青素苷的生物合成。研究结果为探讨牡丹花瓣呈色的分子机制提供了理论依据，也为开展牡丹花色定向育种提供了有价值的线索。

作者贡献声明

韩新蕊：完成实验，分析数据，撰写论文初稿；袁欣和高杰：实验技术指导，协助数据分析；王亮生和王晓晖：提供实验材料，参与数据分析；贾文庆、符真珠和张和臣：实验方案设计规划及论文修订。

参考文献

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