白菜型冬油菜β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达

doi:10.11983/CBB16225

植物学报 ›› 2017, Vol. 52 ›› Issue (5): 568-578.DOI: 10.11983/CBB16225

白菜型冬油菜β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达

马骊¹, 孙万仓^1,^*(), 袁金海¹, 刘自刚¹, 武军艳¹, 方彦¹, 许耀照², 蒲媛媛¹, 白静¹, 董小云¹, 何辉立¹

¹甘肃农业大学农学院, 甘肃省油菜工程技术研究中心, 甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室, 兰州 730070
²河西学院农业与生物技术学院, 张掖 734000

收稿日期:2016-11-23 接受日期:2017-03-24 出版日期:2017-09-01 发布日期:2017-07-10
通讯作者: 孙万仓
基金资助:
国家现代农业产业技术体系(No.CARS-13)、国家自然科学基金(No.31460356, No.31560397, No.3166040, No.31660404)、国家重点基础研究发展计划(No.2015CB150206)、科技部油菜杂种优势利用技术与强优势杂交种创制(No.2016YFD0101300)和甘肃省教育厅科研专项(No.2015A-077)

Expression Analysis of β-1,3-Glucanase Gene from Winter Brassica rapa Under Low Temperature Stress

Li Ma¹, Wancang Sun^1,^*(), Jinhai Yuan¹, Zigang Liu¹, Junyan Wu¹, Yan Fang¹, Yaozhao Xu², Yuanyuan Pu¹, Jing Bai¹, Xiaoyun Dong¹, Huili He¹

¹Gansu Key Laboratory of Crop Improvement and Germplasm Enhancement, Rapeseed Engineering Research Center of Gansu Province, College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China

²College of Agronomy and Biotechnology, Hexi University, Zhangye 734000, China

Received:2016-11-23 Accepted:2017-03-24 Online:2017-09-01 Published:2017-07-10
Contact: Wancang Sun

摘要/Abstract

摘要： 为探明β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase)对油菜(Brassica campestris)抵御低温胁迫能力的作用, 通过蛋白质谱分析得到β-1,3-葡聚糖酶蛋白, 采用RT-PCR技术克隆白菜型冬油菜(B. rapa)陇油6号和天油4号β-1,3-葡聚糖酶的cDNA序列; 并对该序列进行生物信息学分析; 进而采用实时荧光定量PCR及半定量PCR检测β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达模式。结果获得长度为1 032 bp的陇油6号β-1,3-葡聚糖酶基因开放阅读框, 编码343个氨基酸, 相对分子量为38.102 kDa, 理论等电点为6.63, 其与菜心(B. rapa subsp. chinensis)和甘蓝型油菜(B. napus)的蛋白质氨基酸序列同源性高达93.94%。该基因编码的酶是一个主要由α-螺旋组成的亲水性稳定蛋白, 含有1个信号肽, 存在2个跨膜结构域。该基因在进化上高度保守, 其保守序列属于植物的糖基水解酶家族17特有的保守结构域。β-1,3-葡聚糖酶基因表达模式分析显示, 4°C时该基因上调表达, 继续低温(-4°C)胁迫处理, 该基因上调表达至峰值, 至-8°C时其表达下调。研究表明从白菜型冬油菜中克隆的β-1,3-glucanase在冬油菜品种陇油6号抗寒过程中发挥作用。

关键词: β-1, 3-葡聚糖酶基因, 低温, 分子克隆, 表达分析

Abstract: This study examined the function of β-1,3-glucanase in Brassica rapa with low temperature stress, whose encoding protein was identified by protein mass spectrometry analysis. The cDNA sequence of β-1,3-glucanase was cloned by RT-PCR of winter rapeseed from Longyou6 and Tianyou4 cultivars. Semi-quantitative PCR and real-time fluorescence quantitative PCR were used to study the expression pattern of β-1,3-glucanase in response to low temperature stress. The open reading frame of the β-1,3-glucanase gene was obtained at a length of 1 032 bp, and encoded 343 amino acid. The molecular weight was 38.102 kDa and the isoelectric point 6.63, with 93.94% amino sequence similarity to B. rapa subsp. chinensis and B. napus. The protein encoded by this gene is a hydrophilic protein with one signal peptide and two transmembrane domains. The prediction of the secondary structures indicated that β-1,3-glucanase is a protein with more α-helices. The predicted β-1,3-glucanase contains a conserved amino acid sequence corresponding to the plant Glycol-Hydro 17 superfamily. RT-PCR and semi-quantitative RT-PCR results showed that β-1,3-glucanase was upregulated in response to 4°C, and the gene was upregulated to peak in expression at -4°C; However, the expression was inhibited at lower temperature (-8°C). The β-1,3-glucanase gene cloned from the winter B. rapa cv. ‘Longyou6’ might play a role in cold tolerance.

Key words: β-1, 3-glucanase gene, low temperature, molecular cloning, expression analysis

马骊, 孙万仓, 袁金海, 刘自刚, 武军艳, 方彦, 许耀照, 蒲媛媛, 白静, 董小云, 何辉立. 白菜型冬油菜β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达. 植物学报, 2017, 52(5): 568-578.

Li Ma, Wancang Sun, Jinhai Yuan, Zigang Liu, Junyan Wu, Yan Fang, Yaozhao Xu, Yuanyuan Pu, Jing Bai, Xiaoyun Dong, Huili He. Expression Analysis of β-1,3-Glucanase Gene from Winter Brassica rapa Under Low Temperature Stress. Chinese Bulletin of Botany, 2017, 52(5): 568-578.

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图/表 10

图1 白菜型冬油菜陇油6号叶片质外体蛋白图谱M: 标准蛋白; 1: 类枯草菌素蛋白酶; 2: 叶绿体热休克蛋白70-1; 3: 黑芥子酶; 4: S-腺苷-L-同半胱氨酸水解酶; 5: 基本葡聚糖酶; 6: β-1,3-葡聚糖酶; 7: 病程相关蛋白1

Figure 1 Apoplast protein map of Brassica rapa cv. ‘Long- you6’ leavesM: Protein marker; 1: Subtilisin-like protease; 2: Chloroplast heat shock protein 70-1; 3: Myrosinase; 4: S-adenosyl-L- homocystein hydrolase; 5: Basic glucanase; 6: β-1,3-gluca- nase; 7: Pathogenesis- related protein-1

表1 白菜型冬油菜陇油6号叶片质外体蛋白质谱鉴定

Table 1 Mass spectrometry results of apoplast proteins in Brassica rapa cv. ‘Longyou6’ leaves

Spot No.	NCBI accession No.	Protein name	Organism	Score	Sequence coverage (%)
1	gi\|757534	Subtilisin-like protease	Arabidopsis thaliana	146	3
2	gi\|166919370	Chloroplast heat shock protein 70-1	Ipomoea nil	291	6
3	gi\|11034734	Myrosinase	Raphanus sativus	98	6
4	gi\|32967699	S-adenosyl-L-homocystein hydrolase	A. thaliana	290	29
5	gi\|118763538	Basic glucanase	Brassica juncea	315	53
6	gi\|62361691	β-1,3-glucanase	B. rapa subsp.	348	48
7	gi\|722274	Pathogenesis-related protein-1	B. juncea	78	41

图2 菌液PCR电泳产物M: 分子量标准; 1: 菌液PCR产物

Figure 2 Electrophoresis results of bacterial PCRM: DNA marker III; 1: Bacterial PCR product

图3 β-1,3-glucanase基因编码区核酸序列及编码氨基酸序列上游的起始密码子ATG用方框表示; * 为终止密码子TAA的位置。

Figure 3 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of β-1,3-glucanase cDNAAn upstream in-flame start codon ATG is boxed; * indicates the positions of termination codon TAA.

图4 白菜型冬油菜陇油6号β-1,3-葡聚糖酶蛋白生物信息学分析(A) 用ProtScale程序预测蛋白质疏水性; (B) 用Signal P4程序预测信号肽; (C) 用TMpred程序预测β-1,3-葡聚糖酶的跨膜区段; (D) 结构域预测; (E) 二级结构预测; (F) 三级结构预测

Figure 4 Bioinformatic analysis of β-1,3-glucanase protein in Brassica rapa cv. ‘Longyou6’(A) Predicted protein hydrophobicity by ProtScale; (B) Predicted signal peptide by Signal P4; (C) Transmembrane helical segments predicted by TMpred; (D) Predication of domains; (E) Predicted secondary structure; (F) Predicted 3-D structure

表2 十字花科植物β-1,3-glucanase基因编码蛋白的理化性质预测

Table 2 Predicted physicochemical properties of β-1,3-glucanase gene encoding proteins in cruciferae plants

Cruciferous plants	No. of amino acids	Molecular weight (kDa)	Theoretical isoelectric point	Protein instability index	Grand average of hydropathicity	Composition of amino acid	The main amino acid (%)
Longyou6	343	38.102	6.63	39.58	-0.334	20	Asn (9.6), Leu (8.7)
Tianyou4	343	38.130	7.68	39.02	-0.337	20	Asn (9.6), Leu (8.7)
Brassica rapa	342	38.180	7.69	42.99	-0.370	20	Asn (9.6), Leu (8.8)
B. rapa subsp. chinensis	363	40.659	9.27	39.84	-0.335	20	Asn (8.8), Leu (8.3)
B. napus	363	40.599	9.22	39.96	-0.325	20	Asn (9.1), Leu (8.3)
B. oleracea	351	38.925	6.85	40.48	-0.304	20	Asn (8.8), Ser (8.5)
B. oleracea var. oleracea	365	41.075	9.27	37.84	-0.390	20	Asn (8.8), Leu (7.7)
B. juncea	346	38.087	9.13	38.03	-0.188	20	Gly (9.5), Leu (9.0)
Raphanus sativus	345	38.243	6.20	40.33	-0.326	20	Leu (10.1), Asn (8.4)
Arabidopsis thaliana	355	39.380	5.47	47.15	-0.318	20	Ser (9.3), Leu (8.7)

图5 陇油6号β-1,3-葡聚糖酶蛋白的系统进化树

Figure 5 Phylogenetic analysis of Longyou6 β-1,3-glucanase protein

图6 β-1,3-葡聚糖酶蛋白的多序列比对

Figure 6 Sequence comparison of the β-1,3-glucanase proteins

图7 低温胁迫下白菜型冬油菜β-1,3-glucanase基因的半定量RT-PCR分析(A) 陇油6号; (B) 天油4号

Figure 7 Semi-quantitative RT-PCR analysis of β-1,3-glucanase gene in winter Brassica rapa under low temperature stress(A) Longyou6; (B) Tianyou4

图8 低温胁迫下白菜型冬油菜叶片β-1,3-glucanase基因的相对表达量

Figure 8 The relative expression level of β-1,3-glucanase gene in leaves of winter Brassica rapa under low temperature stress

参考文献 29

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